中國荷斯坦公牛SPEF2基因表達與精液品質的相關性分析.pdf

1、隨著牛人工授精技術的廣泛推廣，種公牛對奶牛群體遺傳進展貢獻達70％以上，使得高質量的精液品質與經濟效益直接相關。正常的精子鞭毛對于精子運動和受精能力必不可少，它涉及到多個具有細胞時空特異性的基因協同表達。因此，鑒定新生公牛與成年公牛睪丸中特異表達的基因及其分子調控機理對于闡明睪丸發(fā)育及精子發(fā)生的機理至關重要。已有研究表明，SPEF2（Sperm flagella2）基因與精子鞭毛的正常發(fā)育和男性生殖力密切相關。本試驗通過研究SPEF2基

2、因在中國荷斯坦公牛睪丸、附睪和精子中表達，功能性SNPs的鑒定及啟動子區(qū)甲基化水平分析，以增加對SPEF2基因表達調控機理及其與公牛精液品質的關系的了解，豐富對公牛高繁殖性狀形成的分子機理的認識。
　　一、中國荷斯坦公牛SPEF2基因可變剪接體鑒定
　　利用RT-PCR、克隆測序在公牛睪丸組織中檢測到4種新的SPEF2可變剪接體，分別命名為SPEF2-SV1、SPEF2-SV、SPEF2-SV3和SPEF2-SV4。West

3、ern blot技術檢測到SPEF2蛋白在新生公牛和成年公牛心、肝、脾、肺、腎和睪丸組織的表達。IHC揭示了SPEF2蛋白在睪丸的初級精母細胞、伸長的精子和圓形精子中表達。SPEF2參考轉錄本在成年公牛高精液品質組和低精液品質組中存在差異表達;SPEF2-SV1在除新生公牛肺組織外的其他組織及成年公牛各組織中均有表達，;SPEF2-SV2主要在成年公牛睪九和附睪中表達;SPEF2-SV3僅在成年公牛睪丸和附睪中表達;SPEF2-SV4表

4、達量很低，各組織中（心、肝、脾、肺、腎、附睪和睪丸）未檢測到。因此推測，SPEF2基因表達的不同轉錄本參與精子發(fā)生過程相關。
　　二、與可變剪接體相關的功能性SNP（single nucleotide polymorphism）鑒定
　　通過直接測序技術篩選到2個位于潛在外顯子剪切增強子內的功能性單核苷酸突變位點(SNPs)，c.2851G＞T和g.11043C＞T。經ESEfinder3.0軟件預測發(fā)現，突變位點c.285

5、1G＞T（位于外顯子20內）增加SRp40剪切因子與靶序列的結合位點，可能導致SPEF2-SV3剪切體的產生，并且與精子畸形率和精子解凍后活力顯著相關（P＜0.05）。位于第一內含子內的突變位點g.11043C＞T改變了剪切因子結合蛋白SC35與靶序列的結合位點，它可能是產生異常轉錄本（SPEF2-SV4）的重要原因，此SNP與精子畸形率顯著相關（P＜0.05）。兩個突變位點可作為荷斯坦公牛精液品質選擇的潛在功能性分子標記。
　　

6、三、中國荷斯坦公牛SPEF2基因5'側翼區(qū)核心啟動子鑒定及啟動子區(qū)甲基化分析
　　通過生物信息學預測，在SPEF2基因5'側翼區(qū)預測到一個啟動子及一個CpG島。構建7個缺失片段pGL3重組質粒，瞬時轉染MLTC-1細胞，確定了5'側翼區(qū)核心啟動子位置位于g.-586～g.-157，而預測到的CpG島(g.-430～g.-161)正好位于核心啟動子區(qū)。通過巢式BSP方法獲得了該CpG島序列(271bp)，利用克隆測序方法分析了SPE