中國荷斯坦公牛CAPN1基因表達(dá)及遺傳變異與精液品質(zhì)的相關(guān)性分析.pdf

1、隨著人工授精技術(shù)在牛產(chǎn)業(yè)的廣泛應(yīng)用，種公牛對奶牛群體的遺傳貢獻(xiàn)高達(dá)70％以上，使得精液品質(zhì)的質(zhì)量與牛場經(jīng)濟(jì)效益直接相關(guān)。正常獲能對于精子的受精能力極為重要，該過程由多個具有細(xì)胞時空特異性的基因協(xié)同表達(dá)共同完成。因此研究與精子活力相關(guān)基因的表達(dá)和分子調(diào)控機(jī)理對于闡明精子發(fā)生的機(jī)理至關(guān)重要。全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，CAPN1（calpain1）基因與動物精子活力相關(guān)。本實(shí)驗通過研究CAPN1基因在中國荷斯坦公牛睪丸組織和精子中的表達(dá)，啟動子區(qū)

2、SNPs的鑒定及功能性分析，以增加對CAPN1基因與公牛精液品質(zhì)的相關(guān)性及其表達(dá)調(diào)控機(jī)理的了解，增加了對公牛高繁殖性狀形成的分子機(jī)理的認(rèn)識。
　　1.中國荷斯坦公牛CAPN1基因的表達(dá)與定位
　　CAPN1基因在精子發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用。首先采用RT-qPCR方法測定了CAPN1基因在剛出生公牛和成年公牛睪丸及精子中的表達(dá)量。結(jié)果顯示：CAPN1在剛出生公牛和成年公牛的睪丸及精子中均有表達(dá)，且表達(dá)存在組織差異性。CAPN

3、1在精子中的表達(dá)量最高，且在成年公牛睪丸中的表達(dá)量高于剛出生公牛睪丸的表達(dá)量。然后利用Western blot技術(shù)檢測，發(fā)現(xiàn)CAPN1蛋白在成年公牛睪丸、附睪組織及精子中均有表達(dá)，CAPN1蛋白在精子中的表達(dá)量最高，在不同組織中其表達(dá)量也存在差異。Western blot的結(jié)果與mRAN水平檢測結(jié)果相一致。進(jìn)一步利用IHC(immunohistochemical)技術(shù)揭示了CAPN1蛋白主要在生精上皮（該位置包含精母細(xì)胞、初級精母細(xì)胞和

4、精細(xì)胞）處表達(dá)。最后利用IF(immunofluorescence)技術(shù)發(fā)現(xiàn)CAPN1蛋白表達(dá)于公牛精子頭部。上述系列實(shí)驗結(jié)果表明CAPN1蛋白可能與精子獲能相關(guān)。
　　2.CAPN1基因啟動子活性分析與功能性SNPs的鑒定
　　首先利用在線預(yù)測軟件對牛CAPN1基因的5’側(cè)翼區(qū)序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，然后分別構(gòu)建P1(g.-1638~g.-769)、P2(g.-1306~g.-769)和P3(g.-1012~g.-769)

5、3個啟動子缺失片段重組pGL3載體，并利用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)分析了牛CAPN1基因5’側(cè)翼區(qū)的啟動子活性。將構(gòu)建的含有不同長度啟動子區(qū)片段的pGL3-Basic熒光素報告載體分別瞬時轉(zhuǎn)染MLTC細(xì)胞，根據(jù)熒光素酶活性的強(qiáng)弱初步確定5’端側(cè)翼區(qū)g.-1306~g.-1012位點(diǎn)為CAPN1基因核心啟動子區(qū)。測序發(fā)現(xiàn)在CAPN1核心啟動子區(qū)域存在一個SNP g.-1256 A>C，進(jìn)一步將含有突變型和野生型的啟動子片段分別構(gòu)建入pG

6、L3-Basic熒光素報告載體，分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)突變型啟動子活性顯著高于野生型(P<0.05)。經(jīng)群體基因分型和關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，g.-1256 A>C的3種基因型對精子活力具有顯著影響，其中CC基因型個體的精子活力顯著高于AA基因型個體(P<0.01)。
　　3.啟動子區(qū)SNP g.-1256 A>C影響精子活力的分子機(jī)制
　　CAPN1核心啟動子區(qū)域的SNP g.-1256 A>C能夠增強(qiáng)啟動子的活性，且突變后精子活力顯著

7、提高。為了探究SNP g.-1256 A>C影響精子活力的分子機(jī)制，我們通過RT-qPCR試驗檢測了不同基因型個體中CAPN1 mRNA的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CAPN1 mRNA在CC基因型個體中的表達(dá)量顯著高于AA基因型個體中的表達(dá)量；同時我們運(yùn)用Western blot技術(shù)進(jìn)一步檢測了不同基因型個體精子中CAPN1蛋白的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CC基因型精子中CAPN1蛋白表達(dá)量較高，這一結(jié)果與RT-qPCR定量結(jié)果相符。因此我們推測g.-12