鋅指蛋白A20對急性肺損傷炎癥反應的調控及機制研究.pdf

1、第一部分 A20蛋白在靜脈注射LPS所致大鼠急性肺損傷中的變化及意義
　　 目的：本實驗通過建立大鼠LPS所致急性肺損傷模型，旨在研究A20蛋白在LPS急性肺損傷的表達變化及意義。方法：實驗選用SPF級雄性SD大鼠54只，隨機分為2個實驗組：正常對照組(尾靜脈注射PBS，1ml/只，定義為0h)；LPS組(尾靜脈注射LPS，10mg/kg，濃度為2mg/ml，根據(jù)不同時間點1h，2h，4h，6h，8h，12h，24h，48h分為

2、8個亞組)。所有動物在注射LPS相應時間點放血處死，收集標本，觀察光鏡(HE染色)，檢測肺濕干比(W/D)，行支氣管肺泡灌洗，檢測支氣管肺泡灌洗液(BALF)中蛋白濃度，BALF中有核細胞總數(shù)，BALF中TNF-α、IL-1β水平，肺組織NF-κB DNA結合活性及核蛋白p65水平，肺組織中A20蛋白及mRNA含量，A20定位。結果：與正常對照相比，注射LPS24小時后肺W/D、BALF中有核細胞總數(shù)(×104/ml)及BALF中蛋白濃

3、度(ug/ml)均明顯升高(p<0.05)，光鏡下可見肺泡間隔增厚，有較多炎癥細胞浸潤，肺泡腔內(nèi)可見紅細胞和中性粒細胞滲出；注射LPS后，BALF液中TNF-α、IL-1β水平及肺組織中NF-κB DNA結合活性及核蛋白p65含量隨時間升高，于注射后2h達高峰，之后逐漸下降，但仍高于注射前，且在24h又發(fā)生一過性升高(p<0.05)；肺組織中A20蛋白及mRNA水平也逐漸升高，于注射后2h達高峰，之后下降，但仍高于注射前(p<0.05)

4、；免疫組化示A20在LPS注射后2小時主要表達于肺泡巨噬細胞胞漿。結論：1.健康大鼠靜脈注射LPS10ml/kg24h后可出現(xiàn)急性肺損傷。2。急性肺損傷時，A20蛋白表達升高，且高峰期與ALI早期細胞因子及NF-κB活性一致。3.A20在急性肺損傷早期明顯升高，且表達于肺泡巨噬細胞，由此推測A20可能通過調控肺泡巨噬細胞炎癥活性影響肺損傷。
　　 第二部分 A20對LPS刺激后肺泡巨噬細胞炎癥反應的作用及機制
　　 目的

5、：本實驗通過建立A20基因沉默及過表達肺泡巨噬細胞株研究A20對LPS刺激后肺泡巨噬細胞炎癥活性影響，旨在探討A20對LPS所致肺損傷的作用及機制。方法：實驗選用大鼠肺泡巨噬細胞株(NR8383)，慢病毒法構建A20基因沉默及過表達細胞株，Western Bblot及RT-PCR鑒定A20表達，并行體外培養(yǎng)慢病毒包裝后的A20干擾(A20-SH)、干擾空載(SCR)、過表達(A20)及過表達空載(VEC)細胞株。向培養(yǎng)基中加入LPS進行

6、干預(1ug LPS/ml培養(yǎng)基)，于刺激后0.5、1、2、4小時收集細胞培養(yǎng)上清液及細胞，ELISA法檢測上清液中TNF-α、IL-1β水平及細胞中NF-κB DNA結合活性；Western Blot法檢測A20蛋白及核內(nèi)p65含量；RT-PCR檢測A20、TNF-α、IL-1βmRNA含量。結果：構建的A20-SH肺泡巨噬細胞株中，A20蛋白及mRNA含量較SCR明顯降低(p<0.05)，干擾效率達80％；過表達肺泡巨噬細胞中A20

7、蛋白及mRNA含量較VEC明顯升高(p<0.05)，表達增加10倍以上。LPS刺激后，SCR組及VEC組A20蛋白及mRNA含量升高，且于1h達高峰，之后逐漸下降，而A20-SH組較SCR組明顯降低(p<0.05)，且始終維持在較低水平，A20組較VEC明顯升高(p<0.05)。LPS刺激后各組肺泡巨噬細胞中細胞因子(TNF-α、IL-1β)mRNA及培養(yǎng)上清液中含量、肺組織中NF-κB DNA結合活性及核內(nèi)p65含量都隨時間升高，于1

8、h達高峰，之后逐漸下降；但與SCR相比，A20-SH組明顯升高(p<0.05)；與VEC組相比，A20組水平明顯降低(p<0.05)。結論：1.慢病毒RNAi表達載體及A20過表達載體可分別有效地抑制大鼠肺泡巨噬細胞株中的A20基因表達或增加該基因表達。2.A20基因沉默導致肺泡巨噬細胞NF-κB活性升高，促進TNF-α、IL-1β表達及分泌；反之A20基因過表達能夠抑制肺泡巨噬細胞NF-κB活性及TNF-α、IL-1β表達和分泌。3.