基于A20基因為藥物靶的人工鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子的設計.pdf

1、研究的背景和目的： A20(tumornecrosisfactor，alpha-inducedprotein3，TNFAIP3)基因是腫瘤壞死因子(TNF-α)誘導下的即早反應基因，其表達產(chǎn)物屬于胞漿內(nèi)的一種鋅指類瞬時調(diào)控蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，A20可抑制不同細胞因子(TNF-α、IL-1、NF-κB等)及基因活化引起的細胞凋亡、過度的炎癥反應、免疫排斥、甚至可影響腫瘤的轉(zhuǎn)歸等。在成纖維細胞、B淋巴細胞、WEHI164細胞、NIH3T

2、3細胞及內(nèi)皮細胞中均發(fā)現(xiàn)A20蛋白可抑制TNF誘導的細胞毒作用。實驗證明，A20基因缺陷小鼠在出生一周就顯現(xiàn)明顯的發(fā)育不全，很快出現(xiàn)嚴重的炎癥反應及惡病質(zhì)，對LPS及TNF高度敏感，并過早死亡。 隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，人工干預內(nèi)源性基因表達的方法越來越多，如基因敲除與敲入、反義技術(shù)、核酶技術(shù)、人工轉(zhuǎn)錄因子(artificialtranscriptionfactor，ATF)、以及近期發(fā)展起來的RNA干擾技術(shù)等。不同技術(shù)的優(yōu)

3、缺點存在很大差別，如基因敲除，其技術(shù)手段先進，特異性強，但步驟煩瑣，技術(shù)條件要求非常高，并非一般實驗室容易開展。各種反義技術(shù)多是在基因轉(zhuǎn)錄后水平上進行調(diào)控，其作用往往限于抑制基因的表達，而且需要針對大量的靶標進行設計。ATF技術(shù)則是通過體外構(gòu)建人工轉(zhuǎn)錄因子，入核后識別DNA上的特異性核酸位點，對特定基因的轉(zhuǎn)錄進行調(diào)控，因此利用少量的人工轉(zhuǎn)錄因子往往就能起到很好的調(diào)控效果。其作用效果不但能抑制或減弱特定基因的表達，也可以啟動靶基因的過表達

4、。一個合適的人工轉(zhuǎn)錄因子甚至可以調(diào)節(jié)某個基因家族或是整條代謝通路中的一系列相關(guān)產(chǎn)物，因此人工轉(zhuǎn)錄因子在基礎研究、腫瘤等疾病的基因治療與抗病毒治療等領域都具有廣泛的應用前景。 轉(zhuǎn)錄因子通常由兩個非常重要的結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BindingDomain，BD)和效應結(jié)構(gòu)域(EffecterDomain，ED)。前者具有與特定DNA結(jié)合的特性，后者則發(fā)揮效應作用。由于人工轉(zhuǎn)錄因子可以進行模塊化設計，通過改變DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以靈

5、活選擇其作用靶位，改變其效應結(jié)構(gòu)域則可以對于目的基因進行激活、抑制、甲基化等不同的調(diào)控，應用十分靈活方便。實驗證明，可把兩類不同的結(jié)構(gòu)域以模塊形式在體外相互組合，構(gòu)建新型的人工轉(zhuǎn)錄因子，進而調(diào)節(jié)相應基因的表達。在人工轉(zhuǎn)錄因子的設計過程中，構(gòu)建能夠識別特定基因序列的DNA結(jié)合域是最重要的工作。近年來，用鋅指蛋白作為工具來調(diào)控哺乳動物特定基因表達的研究有了較大發(fā)展，研究方法主要是通過設計鋅指蛋白中的DNA結(jié)合區(qū)域來識別特定的DNA序列，通常

6、為特定基因的啟動子序列，進而通過與其融合設計的效應域?qū)υ摶蜻M行轉(zhuǎn)錄激活或抑制。研究證明，Cys2-His2鋅指蛋白可作為DNA結(jié)合域的一種理想的結(jié)構(gòu)框架。一般來講，一個典型的鋅指蛋白DNA結(jié)合域通常由3個或6個鋅指組成。目前，人工鋅指蛋白(artificialzincfingerprotein，AZP)技術(shù)使人們可直接選擇不同的DNA序列，從而設計出相應的DNA結(jié)合域。 人類基因組計劃所推動的大規(guī)模DNA測序，為生物醫(yī)藥工業(yè)提

7、供了大量可用于新藥開發(fā)的原材料。生物信息學為分子生物學家提供了大量對基因序列進行分析的工具，不但可以從資料的獲取、基因功能的預測、藥物篩選過程中的信息處理等方面大大加快新藥開發(fā)的進程，而且可以大大加快傳統(tǒng)的基因發(fā)現(xiàn)和研究，因而成為各贏利性研究機構(gòu)和醫(yī)藥公司爭奪基因?qū)＠闹匾ぞ摺Ｈ祟惢蚪M測序的推動者塞萊拉公司宣布，將集中精力挖掘蘊涵在基因序列中的信息，尋找制藥的“靶點”。 本研究的主要方法和結(jié)果： 1.確定并克隆A20

8、基因上游假定啟動子序列： 利用生物信息學手段對A20基因上游序列進行分析，顯示A20基因上游-1000～+300序列系GC富集區(qū)，存在諸多反式作用因子結(jié)合元件，并確定基因組NC_000006138230088處堿基“C”為A20基因的TSS。利用Gene2Promoter數(shù)據(jù)包以及McPromoter服務器分析A20基因假定啟動子范圍，確定基因組NC_000006138229786～138230182間的序列作為A20基因的假定

9、啟動子研究序列。 采用巢式PCR方法從人基因組DNA中克隆了A20基因假定啟動子序列，亞克隆到pGL3載體中。通過雙熒光素酶活性實驗分析，證明獲取的假定啟動子序列具有啟動子活性。 2.設計可特異性結(jié)合A20基因上游啟動子區(qū)的人工鋅指蛋白ZFP： 登陸Scripps的ZFtools服務器，提交獲得的A20基因假定啟動子序列，設定各種參數(shù)后，獲得了A20基因上游特定靶序列及相應的人工鋅指蛋白(zincfingerpr

10、otein，ZFP)序列。利用不同生物軟件及在線服務器對ZFP的理化性質(zhì)，各級結(jié)構(gòu)的特征進行了分析，并利用生物信息學手段對獲得的ZFP進行分析及優(yōu)化。 3.檢測ZFP在原核及真核細胞內(nèi)的表達以及與A20基因假定啟動子靶序列的結(jié)合活性： 全基因合成ZFP核酸序列，并構(gòu)建到不同的表達載體中。轉(zhuǎn)染大腸桿菌及COS7細胞，分別利用RT-PCR、SDS-PAGE、WesternBlot、EMSA等手段觀察ZFP的表達情況及生物學活

11、性。結(jié)果顯示ZFP可分別在大腸桿菌及COS7內(nèi)有效表達并具有相應的生物學活性。 4.人工轉(zhuǎn)錄因子ATF的構(gòu)建、表達及活性分析： ATF結(jié)構(gòu)包括：DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(人工鋅指蛋白ZFP)、效應結(jié)構(gòu)域(NF-κB亞基P65蛋白的激活域)、核定位信號(Nuclearlocalizationsignal，NLS)以及FlagFag。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染ATF表達質(zhì)粒到ECV304細胞，分別應用免疫細胞學方法、RT-PCR、WesternBl

12、ot、熒光素酶活性分析及EMSA檢測ATF融合蛋白的表達及生物學活性。結(jié)果顯示ATF在ECV304細胞中可正常表達，并且在NLS引導下能夠完成入核過程；EMSA結(jié)果顯示，ATF能夠特異性結(jié)合目標靶序列；熒光素酶活性實驗顯示，ATF可有效啟動下游基因的表達。 5.ATF人工轉(zhuǎn)錄因子誘導A20基因的表達及抑制細胞凋亡的作用： ATF重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ECV304細胞，觀察ATF啟動A20基因的表達情況。并觀測在內(nèi)毒素刺激條件下，A

13、TF對ECV304細胞凋亡的作用。結(jié)果顯示ATF可啟動內(nèi)源性A20表達，對內(nèi)毒素誘導的細胞凋亡具有明顯的抑制作用。 結(jié)論： 使用生物信息學手段分析了A20基因上游序列，確定了A20基因的TSS及假定啟動子位置。A20基因的TSS位于人基因組NC_000006138230088處，其假定啟動子位于人基因組NC_000006138229786-138230182。采用巢式PCR方法從人基因組中成功克隆了這一序列。 通

14、過雙熒光素酶活性實驗分析，證明克隆的假定啟動子序列具有啟動子生物學活性。 利用ZFtools服務器，獲得了人工鋅指蛋白ZFP的蛋白序列。通過生物信息學方法優(yōu)化獲得了ZFP核酸序列。 把全基因合成的ZFP序列分別亞克隆到不同載體上，構(gòu)建了重組原核及真核表達載體并成功表達。結(jié)果顯示利用生物信息學手段設計的人工鋅指蛋白可在原核及真核細胞內(nèi)正常表達，并具有相應的生物學活性。 以ZFP為DNA結(jié)合域、P65蛋白的激活區(qū)為效