胃癌相關(guān)抗原MGd1-Ag的臨床意義和抗原初步鑒定.pdf

1、【背景】：
　　胃癌是我國常見的惡性腫瘤之一。早期診斷和早期治療對提高患者生存率有重要意義，腫瘤標志物檢測是早期發(fā)現(xiàn)胃癌的重要手段。但是，傳統(tǒng)的腫瘤標志物對胃癌診斷的特異性和敏感性低。MGd1是本實驗室前期利用淋巴細胞雜交瘤技術(shù)成功制備的一株單抗，其抗原命名為MGd1-Ag。初步研究發(fā)現(xiàn)該抗原在胃癌中表達明顯升高，在血清學(xué)診斷中也有一定的價值。目前，基于抗體的分子靶向治療是腫瘤治療的熱點，本研究發(fā)現(xiàn)MGd1在體外能有效抑制胃癌細胞

2、的生長，促進細胞凋亡，有望成為新的治療胃癌的分子靶點。
　　【目的】：
　　在前期研究基礎(chǔ)上，系統(tǒng)地觀察MGd1-Ag在人體各系統(tǒng)和器官的正常組織和腫瘤組織中的表達和分布。并著重觀察其在胃癌中的表達強度與胃癌患者臨床病理參數(shù)之間及預(yù)后的關(guān)系。進一步利用蛋白組學(xué)方法對MGd1-Ag進行初步鑒定。通過體外細胞學(xué)實驗，觀察MGd1單抗對胃癌細胞的直接殺傷作用，為新的抗體類分子靶向藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。
　　【方法】：
　

3、?。?）免疫組織化學(xué)方法檢測MGd1-Ag在人體各組織中的表達和分布，包括全身正常組織和常見的腫瘤組織。
　?。?）檢測胃癌、正常胃組織、淺表性胃炎、腸上皮化生、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶等組織中MGd1-Ag的表達強度和分布。
　?。?）分析MGd1-Ag在胃癌中的表達強度與胃癌各臨床病理參數(shù)之間的相互關(guān)系。從我院收集胃癌術(shù)后手術(shù)標本，進行隨訪，利用Kaplan–Meier法繪制生存曲線，并分析MGd1-Ag與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系。

4、>　?。?）Western blot檢測MGd1-Ag在胃癌細胞系中的表達。根據(jù)Western blot結(jié)果，選用和裂解胃癌細胞系SGC7901和KATOⅢ，利用免疫沉淀和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜分析對MGd1-Ag進行初步鑒定。
　?。?）激光共聚焦檢測MGd1-Ag在胃癌細胞中的定位，流式細胞儀分析MGd1-Ag在胃癌細胞中的陽性百分率。利用體外細胞學(xué)實驗觀察MGd1單抗對胃癌細胞的直接殺傷作用，并從形態(tài)學(xué)觀察細胞的改

5、變。利用流式細胞儀、高內(nèi)涵細胞分析儀和Western blot檢測胃癌細胞經(jīng)MGd1處理后發(fā)生凋亡的比例和相關(guān)凋亡分子的變化。
　　【結(jié)果】：
　　（1）MGd1-Ag在全身33種正常組織中僅在肺上皮細胞中強陽性表達，骨髓造血細胞、食管鱗狀上皮表層、部分結(jié)腸上皮、唾液腺中的黏液腺體為陽性，在部分皮膚基底細胞和乳腺組織少數(shù)腺腔中弱陽性，其余正常組織中均為陰性。在18種腫瘤組織中，胃癌、結(jié)直腸癌和肺癌為強陽性表達，在肝膽管癌、胰

6、腺導(dǎo)管腺癌和子宮鱗狀細胞癌中為陽性，在肝癌、皮脂腺瘤和精原細胞瘤中為弱陽性，其余檢測的腫瘤中均為陰性。
　?。?）在所有檢測的正常胃組織和淺表性胃炎中，MGd1-Ag全部為陰性。但是在部分腸上皮化生和不典型增生中為陽性。在胃癌中，分化越差、分期越高、和存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的，MGd1-Ag的表達越強（P<0.05），而與胃癌患者的性別、年齡沒有明顯關(guān)系。MGd1-Ag在胃癌中的總體陽性率為81.8％（121/148）。Kaplan-Me

7、ier生存分析提示MGd1-Ag在胃癌中的表達與胃癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，其表達越強，胃癌患者的生存時間越短。
　?。?）MGd1-Ag在多種胃癌細胞系中均存在較強的表達，但是在永生化胃黏膜上皮細胞系GES中為陰性。
　　（4）裂解胃癌細胞系 SGC7901和KATOⅢ，利用免疫沉淀富集MGd1-Ag，再用SDS-PAGE進行分離，Western blot和銀染驗證，在95 kD左右可發(fā)現(xiàn)明確的蛋白條帶。再經(jīng)SDS-PAGE電

8、泳，考馬斯亮藍G250染色后，將目的條帶切膠送質(zhì)譜分析，初步鑒定出MGd1-Ag可能為TNFRSF1B Isoform1或ZNF185。
　?。?）激光共聚焦顯微鏡檢測提示MGd1-Ag主要分布于細胞膜，流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)胃癌細胞中MGd1-Ag陽性比例可達95％以上。MGd1在體外能直接抑制胃癌細胞 SGC7901和AGS的生長，并存在劑量依賴關(guān)系。當(dāng)MGd1濃度為100μg/ml時，細胞增殖明顯受到抑制，濃度達到400μg/m

9、l時，其抑制效果達到高峰。流式細胞儀檢測和高內(nèi)涵細胞分析儀均發(fā)現(xiàn)，MGd1處理細胞后，凋亡比例明顯增加。凋亡相關(guān)分子 Bcl-2和Cleaved caspase3表達上調(diào)，而Bax表達下調(diào)。
　　【結(jié)論】：
　　本研究檢測了MGd1-Ag在人體多種正常和腫瘤組織中的表達，發(fā)現(xiàn)該分子僅在少數(shù)腫瘤中高表達，主要分布于消化系統(tǒng)腫瘤。MGd1-Ag在腸上皮化生和不典型增生等癌前病變中的表達上調(diào)。在胃癌中的表達強度與胃癌的分化、分期和