肺癌相關抗原的篩選及鑒定.pdf

1、腫瘤抗原的尋找一直是腫瘤免疫學研究中面臨的重要課題。Sahin報告的SEREX(Serological analysis of recombinant cDNA expression libraries)方法是從體液免疫的角度尋找腫瘤抗原，為尋找腫瘤抗原提供了一種全新的途徑。該方法已經用于多種類型的腫瘤抗原的篩選及鑒定，并發(fā)現(xiàn)了一些新的腫瘤相關抗原，顯示出良好的應用前景。 肺癌是全球最普遍的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和病死率均占各種惡

2、性腫瘤之首，從確診到死亡，其五年存活率不到15﹪，如此高的死亡率主要原因是肺癌難以早發(fā)現(xiàn)、早治療，且預后差。目前肺癌早期診斷的方法有限，因此尋找新的更具優(yōu)勢的腫瘤相關抗原用于肺癌的早期診斷是急需研究的課題。 用SEREX法篩選和鑒定肺癌腫瘤相關抗原的研究在國內外較少。本研究以肺癌患者的血清篩選肺癌組織cDNA表達文庫，鑒定出肺癌表達的腫瘤抗原，并對其中的部分候選抗原做進一步的血清IgG抗體檢測反應分析，期望為肺癌的早期診斷和預后

3、提供新的標記物，為肺癌疫苗的研制及免疫效果監(jiān)測打下基礎，并且為探討肺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機理提供依據。 方法 一、肺癌相關抗原的異體血清篩選1.將肺癌cDNA表達文庫鋪板，轉膜，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導蛋白質表達，3﹪脫脂奶粉封閉，同1∶100稀釋的預吸收血清反應后，與1∶5000稀釋的二抗反應，在二氨聯(lián)苯胺(DAB)的作用下顯色，抗原抗體復合物處呈現(xiàn)紫藍色。重復鋪板和篩選3次，直到獲得陽性重組噬菌體。

4、 2.挑取陽性噬菌斑，噬菌斑塊于SM緩沖液中4℃保存。陽性克隆經過體內剪切，成為pBluescript SK-噬菌粒。 3．提取質粒，Xho I、EcoR I雙酶切初步鑒定插入片段的大小。 4．質粒以T3、T7通用引物測序，序列結果用BLAST軟件搜索Genbank，進行同源性比對分析。 二、篩選出的肺癌抗原的初步血清反應分析1.將第三輪篩選獲得的陽性重組噬菌體鋪板，轉膜，IPTG誘導蛋白質表達，3﹪脫脂

5、奶粉封閉，分剪成大小為1cmx2cm的100份，分別與50例肺癌患者、50例正常人預吸收血清反應后，與1∶5000稀釋的二抗反應，在二氨聯(lián)苯胺(DAB)的作用下顯色，抗原抗體復合物處呈現(xiàn)紫藍色。 2.統(tǒng)計學處理：比較每個克隆在肺癌病例和正常血清的陽性率，肺癌病例的陽性率高于正常血清的是陽性反應克隆。將篩選到的陽性反應克隆進行聯(lián)合檢測，測定其靈敏度和特異度。所有數(shù)據采用SPSS11.0軟件包處理，統(tǒng)計學分析采用X<'2>檢驗、四格

6、表的確切概率法。 結果 1.經過三輪篩選，從5×10<'5>pfu/ml的文庫篩得70個陽性克隆，其插入片段大小為300bp～2800bp不等，平均長度為1.1kb。它們代表63個不同的基因，包括26個功能未知的基因，2個可能的新基因，35個功能已知的基因。在已知功能的基因中，有1個基因與肺癌的發(fā)生、發(fā)展關系密切；34個基因報道與細胞的分化、代謝及信號轉導等有關系，與其它腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關。 2.在35個功能已

7、知的基因中選擇5個肺癌候選抗原基因，用50例肺癌患者和50例正常人血清對它們介導的IgG免疫反應進行檢測、分析，得到3個陽性反應的肺癌相關抗原克隆。 3.把這3個陽性反應抗原克隆聯(lián)合起來分析，發(fā)現(xiàn)同時進行檢測時能夠在保持特異度等基本不變的前提下，明顯提高診斷的靈敏度，具有較大的臨床診斷價值。結論本研究鑒定出的肺癌相關抗原及進一步的血清學分析，有助于進一步闡述肺癌的發(fā)生機制，為肺癌的早期診斷、聯(lián)合檢測及免疫治療提供候選標志物，也為