胃癌細(xì)胞Reg Ⅰ基因第2內(nèi)含的順式調(diào)控功能.pdf

1、研究背景和目的
　　 Reg基因(Regenereting gene,Reg)由RegⅠ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ4個(gè)成員組成1個(gè)基因家族。該家族屬于血凝素類分泌蛋白,功能相當(dāng)于抗凋亡因子、急性反應(yīng)蛋白和神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)因子。人類RegⅠ基因是1個(gè)單拷貝基因,定位于2號(hào)染色體,由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子組成。國(guó)外近年的研究表明,RegⅠ(regeneratinggeneⅠ)蛋白在胃癌組織中高表達(dá)； RegⅠ基因的表達(dá)與胃癌的分化程度、浸潤(rùn)性生長(zhǎng)以及

2、患者的預(yù)后均存在有相關(guān)性。胃癌細(xì)胞中,胃泌素可刺激RegⅠ基因的表達(dá)；高胃泌素血癥病人的胃組織RegⅠ基因高表達(dá)。RegⅠ基因可能是胃泌素促進(jìn)胃癌發(fā)生過(guò)程中的下游基因。
　　 胃泌素是一種由胃腸道G細(xì)胞分泌的多肽類激素。能與胃泌素受體特異結(jié)合,具有營(yíng)養(yǎng)胃粘膜及刺激胃酸分泌的作用。胃泌素對(duì)大多數(shù)正常及惡性變的胃黏膜及腸道黏膜均表現(xiàn)出很強(qiáng)的增殖效應(yīng),而且在胃黏膜的惡性變過(guò)程中起著非常重要的作用。胃泌素對(duì)培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞并無(wú)直接的生長(zhǎng)刺

3、激作用,而是通過(guò)刺激Reg蛋白的表達(dá)來(lái)刺激細(xì)胞的生長(zhǎng)。胃泌素表達(dá)抑制后,胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)明顯受到抑制。但是,胃泌素促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖的機(jī)制尚不清楚。
　　 真核細(xì)胞的基因表達(dá)調(diào)控由順式作用元件(cis-acting element)和反式作用因子(trans-acting factor)相互作用實(shí)現(xiàn)。目前在真核生物的基因中,發(fā)現(xiàn)了很多基因的內(nèi)含子均能夠提高其轉(zhuǎn)錄效率。PegⅠ基因內(nèi)含子是否具有順式調(diào)控功能?本研究分別克隆人白細(xì)胞、胃

4、癌細(xì)胞BGC-823和SGC-7901細(xì)胞RegⅠ基因第2內(nèi)含子,構(gòu)建熒光素酶報(bào)告載體。轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞并經(jīng)G418篩選后,檢測(cè)熒光素酶活性,分析RegⅠ基因第2內(nèi)含子的順式調(diào)控功能。胃泌素孵育含有熒光素酶報(bào)告載體的且穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的胃癌細(xì)胞系,觀察胃泌素對(duì)RegⅠ基因第2內(nèi)含子的順式調(diào)控功能的效應(yīng)。
　　 材料與方法
　　 1.構(gòu)建RegⅠ基因第2內(nèi)含子螢光素酶報(bào)告載體應(yīng)用PCR技術(shù)分別從人白細(xì)胞、胃癌細(xì)胞系BGC-823和SG

5、C-7901克隆RegⅠ基因第2內(nèi)含子,產(chǎn)物經(jīng)XhoⅠ和HindⅢ雙酶切后,將RegⅠ基因第2內(nèi)含子片段克隆入T載體,分別命名為pTR-Human-introm2、pTR-BGC-823-intron2和pTR-SGC-7901-intron2。再亞克隆至螢光素酶報(bào)告載體pGLA,構(gòu)建含RegⅠ基因第2內(nèi)含子的報(bào)告載體,分別命名為pGL4-Human-intron2、pGL4-BGC-823-intron2和pGL4-SGC-7901-

6、intron2。重組質(zhì)粒經(jīng)XhoⅠ/HindⅢ雙酶切、PCR及測(cè)序鑒定。
　　 2.轉(zhuǎn)染及篩選BGC-823細(xì)胞:對(duì)照組,BGC-823細(xì)胞,無(wú)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染；實(shí)驗(yàn)對(duì)照組,轉(zhuǎn)染pGL4；實(shí)驗(yàn)組,分別轉(zhuǎn)染pGL4-Human-intron2和pGL4-BGC-823-intron2。SGC-7901細(xì)胞:對(duì)照組,SGC-7901細(xì)胞,無(wú)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染；實(shí)驗(yàn)對(duì)照組,轉(zhuǎn)染pGL4空質(zhì)粒；實(shí)驗(yàn)組,分別轉(zhuǎn)染pGL4-Human-intron2質(zhì)粒和p

7、GL4-SGC-7901-intron2。應(yīng)用脂質(zhì)體LipofectaminenTM2000轉(zhuǎn)染,G418篩選。
　　 3.熒光素酶活性檢測(cè)加入1×10-6mol/L胃泌素孵育12 h,提取細(xì)胞上清,Glomax熒光檢測(cè)儀檢測(cè)各組細(xì)胞胃泌素孵育前后熒光素酶活性。
　　 4.RegⅠ基因第2內(nèi)含子的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析應(yīng)用rVISTA在線分析軟件分析PegⅠ基因第2內(nèi)含子的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。
　　 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:

8、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行結(jié)果分析。數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,應(yīng)用單因素方差分析進(jìn)行組間數(shù)值差異比較,以P<0.05為差異有顯著性。
　　 結(jié)果：
　　 1.構(gòu)建RegⅠ基因第2內(nèi)含子螢光素酶報(bào)告載體pGL4-Human-intron2、pGL4-BGC-823-intron2和pGL4-SGC-7901-intron2經(jīng)PCR擴(kuò)增及雙酶切鑒定,證明插入片段正確。DNA測(cè)序鑒定,結(jié)果與GenBank報(bào)道的一

9、致,且插入方向正確。
　　 2.轉(zhuǎn)染及篩選G418篩選后得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的pGL4-Human-intron2、pGL4-BGC-823-intron2和pGL4-SGC-7901-intron2胃癌細(xì)胞系。
　　 3.熒光素酶活性檢測(cè):BGC-823細(xì)胞pGL4-Human-intron2組、pGL4-BGC-823-intron2組和pGL4組熒光素酶活性分別為203529±19653.7、14534.71159.3和2

10、36±11.2,實(shí)驗(yàn)組明顯高于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組(P<0.05)；SG-C-7901細(xì)胞pCL4-Human-intron2組、pGL4-SGC7901-intron2組和pGL4組熒光素酶活性分別為10079.5±1134.9、3436.5±34.5和220.5±16.8,實(shí)驗(yàn)組明顯高于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組BGC-823細(xì)胞熒光素酶活性明顯高于實(shí)驗(yàn)組SGC-7901(P<0.05)。
　　 胃泌素孵育后,BGC-823細(xì)

11、胞pGL4-Human-intron2組、pGL4-BGC-823-intron2組和pGL4組熒光素酶活性分別為217018.8±8999.7、18312.7±1691.2和(258.5±34.8),與孵育前無(wú)明顯差異(P>0.05)；SGC-7901細(xì)胞pGL4-Human-intron2組、pGL4-SGC7901-intron2組和pGL4組熒光素酶活性分別為11036.7±1098.4、3526±194.2和262±27.7,

12、與孵育前無(wú)明顯差異(P>0.05)。
　　 4.RegⅠ基因第2內(nèi)含子的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析rVISTA軟件分析,人白細(xì)胞、胃癌細(xì)胞系BGC-823和SGC-7901 RegⅠ基因第2內(nèi)含子均含有轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),其序列為GAGATAATAA。軟件提示該序列可與轉(zhuǎn)錄因子PAX2、SMAD-Q6、AML1-Q6、CAP和NRSE-B結(jié)合。
　　 結(jié)論：
　　 1.RegⅠ基因第2內(nèi)含子具有順式調(diào)控功能。