ZIC1基因對胃癌細胞周期和細胞遷移的影響及其調(diào)控機制研究.pdf

1、我們前期采用cDNA微陣列分析(cDNAmicroarray)和啟動子甲基化檢測發(fā)現(xiàn)ZIC1(Zincfingerofthecerebellum1)基因在胃腸癌細胞和組織中沉默表達或顯著表達顯著下調(diào)，這種低表達現(xiàn)象與啟動子高甲基化相關。ZIC1基因是ZIC基因家族成員之一，定位于人類3號染色體長臂，具有三個外顯子結構和Cys2His2鋅指結構域，轉錄產(chǎn)物是重要的C末端鋅指轉錄因子。近年來的研究表明，ZIC1基因除了在神經(jīng)嵴和腦發(fā)育過程起

2、重要作用外，還與髓母細胞瘤、子宮內(nèi)膜癌、硬纖維瘤和脂肪肉瘤等腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。但有關ZIC1基因對胃癌腫瘤生物學行為的影響和相關分子機制未見文獻報道。
　　 細胞增殖和細胞周期調(diào)控對胃癌發(fā)生發(fā)展起關鍵作用。已經(jīng)證實Sonichedgehog(Shh)信號通路與胃癌的發(fā)病機制聯(lián)系密切，可以調(diào)控胃癌細胞的分化和增殖。MAPK和PI3K信號通路是調(diào)控細胞增殖的重要信號通路，這兩條信號通路的激活還參與細胞周期特別是G1-S期的調(diào)控

3、。
　　 本課題采用現(xiàn)代細胞與分子生物學技術，通過建立外源性過表達ZIC1的胃癌細胞系，了解胃癌發(fā)生中ZIC1基因對細胞增殖、細胞遷移及細胞侵襲等重要生物學功能的影響，并進一步探討ZIC1對胃癌發(fā)生中MAPK、PI3K和Shh信號通路的分子調(diào)控機制。同時采用基因芯片技術對ZIC1下游相關靶基因進行系統(tǒng)篩選，并對關鍵基因進行驗證以明確其對細胞周期和細胞遷移的作用機制。
　　 方法和材料：
　　 1.將胃癌細胞穩(wěn)定轉

4、染pCDNA3.1和pCDNA3.1-ZIC1載體后，采用MTS及Transwell試驗檢測ZIC1對胃癌細胞生物學行為(細胞增殖、遷移及侵襲)的影響。
　　 2.采用流式細胞儀分析過表達ZIC1后胃癌細胞周期和細胞凋亡的變化，采用Westernblot檢測細胞周期相關蛋白(p21，p27，cyclinD1)和細胞增殖MAPK、PI3K信號通路關鍵蛋白(Akt，Erk1/2)的變化。
　　 3.通過建立外源性過表達ZIC

5、1胃癌細胞株，探討其對Shh蛋白表達的影響；進一步利用Cyclopamine阻斷Shh信號通路，研究對細胞周期關鍵蛋白(p21，cyclinD1)的表達及其對胃癌細胞遷移的影響。
　　 4.MKN28細胞穩(wěn)定轉染pCDNA3.1空白載體和pCDNA3.1-ZIC1后，分別收集RNA逆轉錄為cDNA，利用基因表達譜芯片技術檢測篩選ZIC1可能的下游調(diào)控基因，并對其中三個基因CDKN2B，TP53INP1，ARHGAP進行Q-PCR

6、驗證。
　　 結果：
　　 1.過表達ZIC1可抑制胃癌細胞增殖、遷移和侵襲。過表達ZIC1后BGC823胃癌細胞增殖在第1天和第3天顯著減慢(p<0.001)。過表達ZIC1后AGS，BGC823和SGC7901細胞遷移數(shù)量顯著減少(p<0.001)；過表達ZIC1后AGS細胞侵襲數(shù)量明顯下降(p<0.05)。
　　 2.ZIC1可顯著抑制MAPK和PI3K信號通路，進一步調(diào)控了關鍵細胞周期相關蛋白的表達。外源

7、性過表達ZIC1后AGS和SGC7901胃癌細胞在細胞周期G1期DNA的含量增多，而S期DNA含量相應降低。胃癌細胞過表達ZIC1可顯著上調(diào)細胞周期相關蛋白p21，p27的表達，同時抑制cyclinD1表達。過表達ZIC1后AGS，MKN28，BGC823和SGC7901細胞株的p-Erk1/2和p-Akt活性蛋白表達明顯降低，而總蛋白Erk1/2和Akt無明顯改變。
　　 3.ZIC1對胃癌細胞周期蛋白和胃癌細胞遷移的調(diào)控可能

8、與抑制Shh信號通路有關。過表達ZIC1后胃癌細胞株SHHmRNA的表達明顯下降(p<0.01)，Shh蛋白表達水平顯著下調(diào)。Cyclopamine藥物處理抑制Shh信號通路后胃癌細胞ZIC1mRNA表達水平未見明顯變化，細胞周期相關蛋白p21表達上調(diào)，cyclinD1表達下調(diào)。另外，Transwell遷移試驗發(fā)現(xiàn)Cyclopamine藥物處理后胃癌細胞遷移數(shù)量顯著減少(p<0.001)。
　　 4.篩選和驗證胃癌細胞ZIC1調(diào)

9、控下游候選基因。通過人類全基因組芯片篩選出ZIC1下調(diào)下游基因132個，上調(diào)基因66個，功能歸類分析顯示差異基因主要參與細胞周期、細胞增殖、細胞遷移和轉錄調(diào)控等。挑選代表性基因CDKN2B，ARHGAP9，TP53INP1進行Q-PCR驗證，結果與芯片檢測結果基本相符。
　　 結論：
　　 1.過表達ZIC1抑制胃癌細胞增殖、遷移和侵襲等生物學行為。
　　 2.過表達ZIC1顯著抑制Akt、Erk1/2磷酸化水平

10、，進一步調(diào)控了關鍵細胞周期相關蛋白p21，p27和cyclinD1的表達，從而調(diào)控胃癌細胞周期G1/S檢測點。
　　 3.過表達ZIC1抑制胃癌細胞Shh的表達水平。通路抑制劑阻斷Shh下游分子可以影響胃癌細胞p21和cyclinD1表達，并抑制細胞遷移。ZIC1對胃癌細胞周期蛋白和胃癌細胞遷移的調(diào)控可能與抑制Shh信號通路有關。
　　 4.ZIC1可能通過調(diào)控胃癌細胞周期、增殖、遷移和轉錄調(diào)控等相關下游功能基因，從而發(fā)