Pim-2基因調控肝癌細胞HepG2凋亡的研究.pdf

1、細胞死亡有多種方式，但以對壞死(necrosis)和凋亡(apoptosis)的研究最多。早在1907年Collin在研究神經細胞發(fā)育過程中曾描述一種不同于壞死的細胞死亡形態(tài)，50年代Clucksmann總結了這種死亡形態(tài)的特點，但未被重視。直到60年代．Kerr等Ⅲ將其命名為“固縮性壞死”，為突出其與壞死的不同，于1972年重新命名為凋亡。近年來對細胞凋亡的研究越來越多，從單純的形態(tài)學觀察已深人到分子生物學水平的研究．細胞凋亡在外科多

2、種疾病的發(fā)生和轉歸中已受到越來越多的關注。 凋亡誘導基因有p53、Fas、ICE、rpr、Bcl-xs、Bax、Bak、Bad、bid、bik等，凋亡抑制基因有Bc卜2、IAP家族(生存素)、Bcl—x1、Al、Bcl-w、Mcl、BAG一1等，目前研究較多的有p53、Bcl-2、Fas等。在癌基因中，Pim家族的作用得到越來越多的關注。Pim家族屬于絲蘇氨酸激酶，均為逆轉錄病毒引起的鼠白血病細胞中的病毒插入片斷。該家族有三個成

3、員，即Pim-1，2，3。Fox等[2]發(fā)現(xiàn)Pim-2為生長因子依賴性激酶，即必須在有細胞生長因子存在的條件下才能得到轉錄，當缺乏某些生長因子，如IL-3時，其轉錄將被抑制。但如果在細胞培養(yǎng)體系中撤除所有的生長因子，此時加入外源性Pira-2，可使細胞繼續(xù)存活，并抵抗多種凋亡信號的作用，因此Pim-2抑制凋亡的作用卻又是非生長因子依賴性的。 盡管Pim-2最早是作為癌基因被發(fā)現(xiàn)的，但其作用機制與大多數(shù)癌基因并不一致。Pim一2則

4、僅僅抑制細胞凋亡，并不促進細胞的增殖。與凋亡抑制蛋白Akt類似，Pim-2表達的結果體現(xiàn)在當撤除生長因子后，促進細胞自動維持大小形態(tài)、新陳代謝并存活。 肝細胞肝癌的發(fā)生中己認識到腫瘤細胞不僅有增殖和分化異常，同時還有細胞凋亡的異常。諸如癌前病變細胞凋亡機制受阻，機體免癥反應誘導腫瘤細胞凋亡的功能不全，基因水平上誘導凋亡基因(如p53、bax)的失活以及抑制凋亡基因(如bc卜2)的過分表達等【引。由于肝細胞肝癌惡性程度高，目前的治

5、療措施效果均不理想，尤其是對化療極不敏感，即化療藥物很難誘導肝癌細胞發(fā)生凋亡。我們推測，在肝細胞肝癌發(fā)生發(fā)展過程中，以及對很多化療藥物的“天然”欠敏感或耐受，也極有可能存在Pim-2的作用。 鑒于此，本研究立足于在離體細胞學實驗中是被國際公認的替代正常肝細胞的細胞株HepG2[4,51，作為我們的研究對象。人類肝癌細胞系HepG2來源于人肝細胞癌組織，與正常肝細胞在細胞增殖動力學上具有同源性，通過RT-PCR、電泳等技術證明Pi

6、m一2基因是否在肝癌細胞HepG2中有表達，并采用體外RNA干擾技術(RNAinterference，RNAi)干擾HepG2細胞的Pim一2基因表達等策略，結合光鏡、流式細胞技術、TUN-EL、AnnexinV／PE雙染法等現(xiàn)代分子技術，試圖闡明Pim-2在肝癌細胞系HepG2細胞凋亡機制中的作用，得出主要的實驗結果與結論如下： L肝癌細胞HepG2和正常肝細胞張氏細胞在同一條件下培養(yǎng)，含10％胎牛血清的RPMll640和青、

7、鏈霉素培養(yǎng)液中，37℃，C02濃度為5％。培養(yǎng)48小時后進行RT一PCR反應，產物進行瓊脂糖凝膠電泳，結果進行半定量分析，發(fā)現(xiàn)HepG2中Pim-2的含量明顯高于張氏細胞中Pim-2的含量。 2．利用質粒載體pGenesil-1構建針對Pim-2基因特異性的帶綠色熒光蛋白的SiRNA質粒pPim一2-shRNAA、B、C。將重組質粒進行酶切及測序證實SiRNA重組質粒構建成功。 3．將重組質粒pPim一2一shRNAA、

8、B、C轉染HepG2細胞，熒光鏡下觀察其在HepG2細胞中的轉染效率為85％。將轉染了pPim-2-shRNAA、B、C的HepG2細胞進行RT-PCR反應，再進行半定量分析，結果發(fā)現(xiàn)轉染了pPim-2-shRNAA的Hep62細胞在48h時Pim-2的含量最低，故選取轉染pPim-2-shRNAA的HepG2細胞和轉染陰性對照pPim-2-shRNAC的HepG2細胞進行流式細胞儀、AnnexinV／PE雙染法、TUNEL等方法分析細