GhDET2和GhKTN1在棉花纖維細胞發(fā)育中的功能.pdf

1、棉花是世界上最重要的天然纖維作物，我國是重要的產棉大國和紡織品出口國，棉花在我國國民經濟中占有十分重要的地位。棉花纖維是棉花生產的主產品，提高棉花纖維的產量和品質一直是棉花育種的主要目標。傳統育種方法曾經為棉花產量和品質的提高做出了巨大貢獻，但利用傳統育種方法難以打破纖維產量和品質的負相關，難以達到產量和品質的同步提高。利用基因工程方法可以打破物種間的遺傳障礙，實現優(yōu)良目的基因的定向轉移，且后代易于穩(wěn)定，育種周期短。為進一步改良棉花纖維

2、產量和品質提供了一條有效途徑。利用基因工程改良棉花纖維的產量和品質必須具備兩個條件：①清楚棉花纖維產量和品質形成的分子機理，②克隆與纖維產量和品質發(fā)育直接相關的目標基因和調控序列。因此，分離與棉花纖維產量和品質發(fā)育相關基因及其特異啟動子，分析基因功能和解析纖維發(fā)育的分子機制對改良棉花纖維產量和品質具有重要的理論意義和實踐價值。 植物激素調控植物生長發(fā)育的各個方面，因此棉花纖維的生長發(fā)育也離不開植物激素的調控。油菜素類固醇物質(B

3、Rs)是一類新型的植物激素，外源施用結果表明BRs能提高棉花的產量和品質。然而外源施用植物激素不僅耗工費時、增加生產成本，而且效果也不穩(wěn)定。利用基因工程調控棉花胚珠和纖維中內源BRs的水平，不僅可以闡明BRs在棉花纖維發(fā)育中的作用，還可以改良棉花纖維的產量和品質。 細胞骨架在棉花纖維的生長發(fā)育中也具有重要作用，纖維細胞的伸長和次生壁的合成與周質微管的排列模式具有密切關系。細胞伸長時，周質微管橫向排列；細胞次生壁合成時，周質微管縱

4、向排列，且周質微管的排列方向與新形成的纖維素微纖絲的排列方向高度一致。微管排列方向的變化與調控微管聚合和解聚的因子有直接關系，調控微管的排向可以影響纖維的伸長和次生壁合成，改變纖維的品質。 為了調控棉花內源BRs的含量和微管骨架的排列模式，我們克隆了BRs生物合成的限速酶基因——類固醇5α-還原酶基因和調控微管運動的重要基因——微管切割蛋白基因。并對其進行了表達分析和酶活性鑒定，然后利用煙草和棉花的遺傳轉化分析了棉花類固醇5α-

5、還原酶基因(GhDET2)和棉花微管切割蛋白基因(GhKTN1)的功能。主要結果如下： 一、棉花類固醇5α-還原酶基因(GhDET2)的功能1、棉花類固醇5α-還原酶基因的克隆和表達分析通過對棉花纖維發(fā)育EST序列的篩選和整合，利用3’-RACE，克隆了GhDET2基因。該基因氨基酸序列與擬南芥、矮牽牛和大豆等物種的類固醇5α-還原酶有較高的同源性，并具有同類蛋白應有的保守結構域和發(fā)揮正常生物功能所必需的保守氨基酸殘基。說明Gh

6、DET2基因是類固醇5α-還原酶的同源基因。該基因在棉花基因組中以單拷貝存在，且編碼區(qū)段沒有內含子。5’-上游序列比較表明GhDET2基因可能來源于D亞基因組。Northem和RT-PCR結果表明：GhDET2基因在棉花纖維細胞快速伸長期(5～10DPA)的表達水平最高，同時該基因在徐州142無絨無絮突變體0DPA胚珠中的表達水平僅為同期野生型胚珠的1/5。這些結果顯示GhDET2基因在棉花纖維的起始和快速伸長過程中具有重要作用。 2、

7、GhDET2的生物化學功能鑒定為了驗證GhDET2的生物化學功能，將GhDET2基因導入中國倉鼠卵母細胞(CHO)中表達。體外還原系統檢測結果表明，GhDET2能夠將類固醇5α-還原酶的典型底物——黃體酮還原成為二氫黃體酮，說明GhDET2具有類固醇5α-還原酶的活性。并且GhDET2的活性能夠被類固醇5α-還原酶的特異抑制劑——Finasteride抑制，進一步說明克隆的GhDET2基因就是棉花類固醇5α-還原酶基因。 3、通

8、過轉基因煙草分析了GhDET2基因的功能為了分析GhDET2基因在植物生長中的功能，將GhDET2基因導入煙草。GhDET2基因的超量表達可以增加轉基因煙草的生物生長量，促進營養(yǎng)生長和生殖生長。轉基因種子的千粒重增加53.1﹪。下胚軸長度增加80﹪。根的長度增加190﹪。并且能夠促進側根、不定根以及根毛的發(fā)生和生長，以及增強根尖對重力的反應。這些表型變異與外源施用BL有相似之處。同時利用類固醇5α-還原酶的特異抑制劑Finasterid

9、e則可以抑制野生型煙草根和下胚軸的生長，減弱轉基因煙草根和下胚軸的生長。這些結果說明超量表達GhDET2基因增加了內源BRs的含量。并以此分析了BRs與其它植物激素的相互關系：IAA與BRs在對下胚軸生長上是相互獨立的，對根生長上是相互拮抗的；與此相反，IBA與BRs在對下胚軸生長上是相互拮抗的，對根生長上是相互獨立的。BRs與細胞分裂素對根的生長具有獨立作用，而對下胚軸的生長具有相互拮抗關系。BRs與赤霉素在根生長方面存在協同作用關系

10、，而在對下胚軸生長兩者具有一定的拮抗作用。BRs與脫落酸在種子萌發(fā)和根生長方面具有拮抗作用，但對下胚軸的生長具有相對獨立性。 4、超量表達和反義抑制GhDET2對棉花生長和纖維細胞發(fā)育的影響為了研究GhDET2基因在棉花生長發(fā)育、特別是纖維生長發(fā)育中的功能，獲得了超量表達和反義抑制GhDET2的轉基因棉花，分析了轉基因棉花的表型變化。超量表達GhDET2基因導致棉花植株矮化、側枝變短增多、頂端優(yōu)勢減弱；花粉育性下降、棉桃在開花后

11、3～5天脫落、不能得到成熟的種子和纖維。反義抑制GhDET2基因導致棉花植株嚴重矮化、側枝變短、葉小色深；頂端優(yōu)勢和花粉育性喪失、棉桃在開花后3～5天脫落、不能得到成熟的種子和纖維。 掃描電鏡觀察發(fā)現反義抑制GhDET2的轉基因胚珠表面突起的纖維細胞明顯減少，而且伸長受到抑制。進一步采用胚珠離體觀察纖維細胞的發(fā)育：反義抑制GhDET2和類固醇5α-還原酶抑制劑處理均導致纖維的伸長生長受到嚴重抑制，而添加油菜素內酯則可部分恢復纖維

12、細胞的伸長。表明GhDET2對纖維細胞的起始與伸長均有重要影響。 5、種皮特異啟動子控制senseGhDET2提高了棉纖維細胞數量和長度組成型超量表達正向與反義GhDET2基因導致植株生長不正常，為了排除植株生長不正常對纖維細胞發(fā)育的影響，利用種皮特異性啟動子PFBP7構建了PFBP7::senseGhDET2和PFBP7::antisenseGhDET2植物表達載體并進行了棉花遺傳轉化。表達分析顯示GhDET2基因的表達水平在

13、部分PFBP7::senseGhDET2轉基因胚珠和纖維中有所提高，相反，在PFBP7::antisenseGhDET2轉基因胚珠和纖維中有一定程度的降低。在GhDET2基因表達明顯提高的植株中纖維細胞的起始數量增加了22.6﹪，成熟纖維的長度增加了10.75﹪，種子變大，短絨增加，但纖維的強度和細度沒有明顯變化。相反，在PFBP7::antisenseGhDET2轉基因植株中，伴隨GhDET2基因表達水平的降低，纖維細胞的起始數量減少

14、了21.4﹪，成熟纖維的長度降低了6.38﹪，這些結果在植株水平上說明GhDET2基因對棉纖維細胞的起始和伸長具有重要作用，可作為基因工程改良棉纖維產量和品質的重要基因。 二、棉花微管切割蛋白基因(GhKTN1)的功能1、棉花微管切割蛋白基因的克隆和表達分析通過對棉花纖維發(fā)育EST序列的篩選和整合，克隆了棉花微管切割蛋白基因(GhKTN1)的部分cDNA序列。經過基因組步行，獲得GhKTN1基因的完整ORF框序列，全長1563b

15、p，編碼520個氨基酸。該氨基酸序列與擬南芥和水稻微管切割蛋白的同源性較高，且具有微管切割蛋白保守的AAATPase結構域，推導的三維結構與擬南芥微管切割蛋白的三維結構基本一致。說明GhKTNl基因是微管切割蛋白的同源基因。GhKTN1在16DPA和20DPA纖維中的表達水平明顯躍升。說明該基因在纖維次生壁合成起始和次生壁合成過程中具有重要作用。 2、GhKTN1能夠調控纖維細胞次生壁合成起始和促進次生壁合成Paredez等人(

16、2006)的研究表明，微管的運動與纖維素的合成密切相關。本研究中超量表達和反義抑制GhKTN1基因都使微管的排列方式發(fā)生明顯改變；微管切割蛋白基因表達水平的增加，可以促進微管的運動，進而促進纖維素的合成。本研究對弄清微管運動與纖維細胞發(fā)育的機理有重要的理論意義。 提高GhKTN1基因的表達水平導致纖維長度縮短，纖維次生壁厚度增加，纖維強度增加：反之，降低GhKTN1基因的表達水平導致纖維次生壁厚度減少、纖維強度降低。GhKTN1