角蛋白24在表皮角質(zhì)形成細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞中的作用研究.pdf

1、角蛋白是一類典型的上皮細(xì)胞中間絲蛋白，具有分子多樣性的特點(diǎn)。在人類，存在54種功能角蛋白基因。在不同的上皮類型或者不同的細(xì)胞分化狀態(tài)中，角蛋白的表達(dá)形式存在特異性。作為上皮細(xì)胞骨架的組成部分，角蛋白在維持上皮細(xì)胞機(jī)械穩(wěn)定性和組織完整性中參與重要作用。除了結(jié)構(gòu)性功能外，近年來(lái)，一些角蛋白還被發(fā)現(xiàn)具有新的調(diào)節(jié)功能，如參與細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、創(chuàng)傷應(yīng)答和組織重塑。
　　角質(zhì)形成細(xì)胞是皮膚表皮的主要構(gòu)成細(xì)胞，皮膚通過(guò)調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和分

2、化來(lái)維持其屏障功能。在角質(zhì)形成細(xì)胞分化之初，角質(zhì)形成細(xì)胞主要表達(dá)早期分化標(biāo)記物，如:角蛋白1和角蛋白10。隨著分化的不斷進(jìn)展，角質(zhì)形成細(xì)胞開始表達(dá)不同的分化相關(guān)蛋白，如:fillaggrin，involucrin，loricrin，角蛋白2等。
　　既往研究發(fā)現(xiàn)，角蛋白異常與包括增殖性皮膚病和遺傳性皮膚病在內(nèi)的多種皮膚疾病相關(guān)。在銀屑病中，角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖與分化存在異常，角質(zhì)形成細(xì)胞表現(xiàn)為高增殖和異常分化的狀態(tài)，而這些是銀屑病皮

3、損形成的主要原因。
　　皮膚創(chuàng)傷修復(fù)是一種復(fù)雜的生理過(guò)程，由多種類型的細(xì)胞和信號(hào)通路的參與。其中，真皮成纖維細(xì)胞已被廣泛用于皮膚創(chuàng)傷修復(fù)機(jī)制的研究中。既往研究已經(jīng)闡明，真皮成纖維細(xì)胞的遷移、增殖以及其分泌細(xì)胞外基質(zhì)的功能在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用?；诔衫w維細(xì)胞的細(xì)胞療法可以作為皮膚過(guò)度炎癥和組織修復(fù)延遲的一種治療方法。與此同時(shí)，既往研究亦表明，角蛋白在對(duì)皮膚創(chuàng)傷愈合和組織修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。角蛋白敷料可防止傷口干燥，促進(jìn)皮

4、膚屏障建立，從而促進(jìn)傷口愈合。
　　角蛋白24(Keratin24，K24)是一種新型角蛋白，它是一種包含有525個(gè)氨基酸的角蛋白樣蛋白，屬于Ⅰ型角蛋白聚合物。K24在角質(zhì)形成細(xì)胞、胎盤、結(jié)腸、脾臟中表達(dá)較豐富。在人類，有研究發(fā)現(xiàn)，K24可能是早期大腸癌的發(fā)病的易感基因。亦有研究表明，K24參與角膜上皮細(xì)胞的終末分化。然而其在皮膚細(xì)胞中的生物學(xué)功能尚未闡明。
　　目的：
　　本研究目的在于，一方面通過(guò)研究K24在表皮角

5、質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)及生物學(xué)作用，為探索K24與銀屑病之間的關(guān)聯(lián)奠定基礎(chǔ);另一方面，通過(guò)研究K24在真皮成纖維細(xì)胞中的作用及功能，以期發(fā)現(xiàn)其在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)中的潛在應(yīng)用價(jià)值。
　　方法：
　　第一部分:分離培養(yǎng)正常人及銀屑病患者皮損區(qū)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA和蛋白質(zhì)。通過(guò)qRT-PCR和Western blot法檢測(cè)正常人以及銀屑病患者皮損區(qū)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中K24的mRNA及蛋白表達(dá)水平;利用細(xì)胞和組織免疫熒光法檢測(cè)

6、正常角質(zhì)形成細(xì)胞和人體皮膚組織中K24的表達(dá)和定位;通過(guò)體外傳代和CaCl2誘導(dǎo)分化兩種方法，觀察不同分化狀態(tài)的角質(zhì)形成細(xì)胞中K24的表達(dá)差異。利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，建立過(guò)表達(dá)K24的角質(zhì)形成細(xì)胞模型。通過(guò)qRT-PCR和Western blot法驗(yàn)證慢病毒轉(zhuǎn)染后K24在角質(zhì)形成細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的效率。利用Western blot法分析K24過(guò)表達(dá)后其下游蛋白分子，如細(xì)胞分化、細(xì)胞周期、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、PKC信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平;通過(guò)細(xì)胞

7、功能學(xué)實(shí)驗(yàn)方法觀察K24過(guò)表達(dá)對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、分化、衰老、凋亡以及遷移的影響。構(gòu)建Krt24-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠，獲得穩(wěn)定陽(yáng)性子代后，分離培養(yǎng)其表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，通過(guò)qRT-PCR法，與野生型小鼠表皮角質(zhì)形成細(xì)胞對(duì)比分析，驗(yàn)證前述實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　第二部分:利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，構(gòu)建過(guò)表達(dá)K24的真皮成纖維細(xì)胞模型，并通過(guò)qRT-PCR和Western blot法確認(rèn)慢病毒的感染效率。繼而主要通過(guò)qRT-PCR、Weste

8、rn blot法及細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)方法研究K24過(guò)表達(dá)后對(duì)真皮成纖維細(xì)胞增殖、遷移、衰老的影響。分離培養(yǎng)Krt24-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠真皮成纖維細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞功能學(xué)檢測(cè)以及qRT-PCR法，與野生型小鼠真皮成纖維細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比分析，驗(yàn)證前述實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　結(jié)果：
　　一、K24在表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)及作用
　　1.Western blot結(jié)果提示，體外培養(yǎng)的銀屑病皮損區(qū)來(lái)源的角質(zhì)形成細(xì)胞中K24的蛋白表達(dá)水平低于正常角質(zhì)

9、形成細(xì)胞。
　　2.細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，K24在正常人角質(zhì)形成細(xì)胞中呈胞漿分布;組織免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在正常人表皮中，K24主要表達(dá)于棘細(xì)胞上層，在基底層及棘層少量表達(dá)。
　　3.通過(guò)體外傳代和Ca2+誘導(dǎo)兩種方法誘導(dǎo)人角質(zhì)形成細(xì)胞分化發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，K24在衰老及分化較為明顯的角質(zhì)形成細(xì)胞中蛋白表達(dá)更豐富。
　　4.MTS及EdU檢測(cè)提示，與對(duì)照組相比，正常人角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)表達(dá)K24后，增殖能力及細(xì)胞活性降低;

10、流式細(xì)胞周期結(jié)果顯示，K24過(guò)表達(dá)的人角質(zhì)形成細(xì)胞出現(xiàn)了細(xì)胞周期的G1/S期阻滯;Western blot結(jié)果進(jìn)一步提示，增殖相關(guān)蛋白K14、K17、c-Myc表達(dá)下調(diào);細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p53，p21表達(dá)上調(diào)。
　　5.透射電鏡法及流式凋亡檢測(cè)提示，K24過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)自噬并促進(jìn)人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡的發(fā)生;Western blot結(jié)果提示，自噬相關(guān)蛋白Atg5和Atg7，凋亡相關(guān)蛋白Cleaved caspase-3表達(dá)上調(diào)。

11、>　　6.Western blot結(jié)果提示，K24過(guò)表達(dá)促進(jìn)人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的分化，角質(zhì)形成細(xì)胞分化相關(guān)蛋白K1，loricrin和involucrin的表達(dá)上調(diào)。
　　7.細(xì)胞免疫熒光結(jié)果提示，K24過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞骨架蛋白α-tubulin表達(dá)上調(diào);β半乳糖苷酶檢測(cè)提示，K24過(guò)表達(dá)亦促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞衰老的發(fā)生。
　　8.Transwell試驗(yàn)結(jié)果提示，K24過(guò)表達(dá)抑制人表皮角質(zhì)形成

12、細(xì)胞的遷移能力;Western blot結(jié)果提示，K24過(guò)表達(dá)促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白E-cadherin表達(dá)上調(diào)，N-cadherin和Slug表達(dá)下調(diào)。
　　9.Western blot結(jié)果提示，人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)表達(dá)K24后，與對(duì)照組相比，PKCδ蛋白磷酸化水平增加。
　　10.qRT-PCR結(jié)果提示，與野生型小鼠來(lái)源的表皮角質(zhì)形成細(xì)胞相比，Krt24過(guò)表達(dá)小鼠來(lái)源的表皮角質(zhì)形成細(xì)胞在過(guò)表達(dá)Krt24mRNA的

13、基礎(chǔ)上，低表達(dá)Krt14，高表達(dá)loricrin及involucrin，高表達(dá)p21及p53，提示Krt24轉(zhuǎn)基因小鼠表皮角質(zhì)形成細(xì)胞增殖能力減弱，呈趨于分化及衰老的狀態(tài)。
　　二、K24對(duì)真皮成纖維細(xì)胞的作用及功能影響
　　1.K24過(guò)表達(dá)通過(guò)促進(jìn)人真皮成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期由G1期向S+G2/M期過(guò)渡，從而增強(qiáng)了成纖維細(xì)胞的增殖及克隆形成能力。
　　2.K24過(guò)表達(dá)促進(jìn)人真皮成纖維細(xì)胞的遷移能力，上調(diào)間質(zhì)表型標(biāo)記蛋白

14、:α-SMA、FN、β-catenin、MMP3及細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)物Collagen1a在蛋白水平的表達(dá)。
　　3.K24過(guò)表達(dá)抑制人真皮成纖維細(xì)胞的衰老，同時(shí)抑制了細(xì)胞周期及衰老相關(guān)蛋白p53、HMGN2、HMGB2在mRNA及蛋白水平的表達(dá)。
　　4.MTS檢測(cè)提示，Krt24轉(zhuǎn)基因小鼠來(lái)源的真皮成纖維細(xì)胞較野生型小鼠來(lái)源的真皮成纖維細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)。
　　5.Transwell結(jié)果提示，Krt24轉(zhuǎn)基因小鼠來(lái)源的真皮

15、成纖維細(xì)胞較野生型小鼠來(lái)源的真皮成纖維細(xì)胞遷移能力增強(qiáng);qRT-PCR結(jié)果提示，在mRNA水平，與野生型小鼠成纖維細(xì)胞相比，Krt24轉(zhuǎn)基因小鼠成纖維細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)下調(diào)，而FN、N-cadherin、α-SMA、Vimentin、PAI-1和MMP3表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步提示Krt24轉(zhuǎn)基因小鼠來(lái)源的真皮成纖維細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)。
　　6.qRT-PCR結(jié)果提示，在mRNA水平，與野生型小鼠真皮成纖維細(xì)胞相比，Krt24轉(zhuǎn)

16、基因小鼠真皮成纖維細(xì)胞中Collagen1a和Collaggen3a表達(dá)上調(diào)，提示Krt24轉(zhuǎn)基因小鼠真皮成纖維細(xì)胞膠原合成能力增強(qiáng)。
　　結(jié)論：
　　K24在正常角質(zhì)形成細(xì)胞中蛋白水平高于銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞。在正常人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中，K24主要呈胞漿分布;在正常人表皮中，K24主要表達(dá)于棘細(xì)胞上層。K24過(guò)表達(dá)于表皮角質(zhì)形成細(xì)胞后，抑制角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、遷移，促進(jìn)細(xì)胞分化、衰老、自噬及凋亡的發(fā)生。
　　K24過(guò)表達(dá)