膽囊癌體細(xì)胞突變篩查及初步功能學(xué)研究.pdf

1、目的:體細(xì)胞基因突變?cè)斐傻陌┗蚣せ钆c抑癌基因失活在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著至關(guān)重要的作用。本研究擬通過對(duì)膽囊癌體細(xì)胞突變的篩查來發(fā)掘其發(fā)病的驅(qū)動(dòng)基因，從而為揭示膽囊癌的發(fā)生機(jī)制，及開發(fā)膽囊癌的靶向治療藥物提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:利用全基因組外顯子測序技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)對(duì)22對(duì)膽囊癌組織的體細(xì)胞突變情況進(jìn)行篩查，Sanger測序驗(yàn)證篩查結(jié)果;針對(duì)所篩高頻突變基因HDGF，構(gòu)建HDGF-siRNA慢病毒載體，并轉(zhuǎn)染膽囊癌細(xì)胞

2、株，通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)沉默HDGF后對(duì)膽囊癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響;最后，收集66例膽囊癌石蠟標(biāo)本，通過免疫組化技術(shù)分析HDGF蛋白表達(dá)與膽囊癌臨床病理和預(yù)后的關(guān)系。
　　結(jié)果:我們通過22對(duì)膽囊癌樣本全基因組外顯子測序，成功的鑒定出507個(gè)高質(zhì)量的體細(xì)胞突變。其中HDGF、AKAP11、BPTF等基因突變頻率較高(均為9.1％，2/22);針對(duì)HDGF，我們進(jìn)一步在66例膽囊癌石蠟樣本中進(jìn)行了Sanger測序驗(yàn)證，結(jié)果顯示其突變頻

3、率為10.6％(7/66)。隨后為了解HDGF的細(xì)胞生物學(xué)功能，我們利用HDGF-siRNA消減了膽囊癌細(xì)胞株中HDGFmRNA的表達(dá)水平，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示膽囊癌細(xì)胞株的增殖、侵襲能力明顯下降;流式細(xì)胞周期檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期發(fā)生了S期阻滯;且sub-G1期腫瘤細(xì)胞明顯增加，提示促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。最后，利用免疫組化檢測膽囊癌組織中HDGF蛋白表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HDGF主要位于胞核，其表達(dá)顯著高于對(duì)照膽囊炎組，HDGF蛋白表達(dá)與組織分化程度及

4、神經(jīng)侵潤有關(guān)，Kaplan-Meier生存分析顯示患者術(shù)后生存期與HDGF表達(dá)、腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴轉(zhuǎn)移及神經(jīng)浸潤有關(guān)，Cox回歸多因素分析結(jié)果顯示HDGF表達(dá)可作為膽囊癌的獨(dú)立預(yù)后因素。
　　結(jié)論:全基因組外顯子測序技術(shù)有助于找尋潛在關(guān)鍵的癌基因及抑癌基因，為膽囊癌的分子診斷提供參考，為膽囊癌的治療尋找新的靶點(diǎn)，也為預(yù)測膽囊癌的預(yù)后提供新的分子標(biāo)記物;體細(xì)胞突變是HDGF功能激活的重要原因，并推測其功能激活后在膽囊癌的