PTD-GFP、PTD-EDAG融合蛋白質(zhì)的表達(dá)、純化和初步應(yīng)用.pdf

1、EDAG是一種與造血細(xì)胞分化調(diào)控密切相關(guān)的核蛋白質(zhì)，對(duì)造血系統(tǒng)發(fā)育分化起重要調(diào)控作用，但對(duì)其作用機(jī)制尚缺乏深入的了解。因此，將EDAG蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)入造血干細(xì)胞內(nèi)，研究其對(duì)造血干細(xì)胞增殖、分化、凋亡調(diào)控的影響，將對(duì)闡明其作用機(jī)制及應(yīng)用前景具有重要意義。 為將EDAG蛋白質(zhì)有效導(dǎo)入造血干細(xì)胞，我們采用了基于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域（protein transduction domain，PTD）的蛋白質(zhì)跨膜遞送技術(shù)。它能將與之融合的蛋白質(zhì)以一

2、種濃度依賴的方式跨膜導(dǎo)入細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)濃度近乎相同，且對(duì)細(xì)胞損傷較小。目前，其在醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中的應(yīng)用已受到廣泛的關(guān)注。 為優(yōu)化跨膜遞送技術(shù)各環(huán)節(jié)的條件，我們選擇綠色熒光蛋白質(zhì)（GFP）為研究對(duì)象，系統(tǒng)摸索了表達(dá)、純化、轉(zhuǎn)導(dǎo)等條件。我們首先采用DNA重組技術(shù)構(gòu)建了PTD-GFP表達(dá)載體，共構(gòu)建VP22-GFP、Tat-GFP、Tat-GFP-Tat、Tat-GFP-9R4種融合蛋白質(zhì)原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染大腸桿菌

3、BL21，經(jīng)過摸索誘導(dǎo)劑濃度、菌密度、誘導(dǎo)時(shí)間等條件，得到各融合蛋白質(zhì)的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件。在采用Ni-NTA親和純化柱純化融合蛋白質(zhì)時(shí)，我們嘗試了兩種純化途徑：一是天然蛋白質(zhì)直接上柱純化（Native條件）、二是先對(duì)表達(dá)蛋白質(zhì)變性，然后純化并復(fù)性（Hybrid條件）。比較兩種純化路線所得蛋白質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)能力發(fā)現(xiàn)，Hybrid途徑純化的融合蛋白質(zhì)具有較強(qiáng)的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)能力，其中Tat-GFP-Tat蛋白質(zhì)具有最強(qiáng)的活性。 隨后，我們分

4、別構(gòu)建了VP22-EDAG、Tat-EDAG、Tat-EDAG-Tat和Tat-EDAG-9R的原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染大腸桿菌BL21，經(jīng)誘導(dǎo)均可表達(dá)目的蛋白質(zhì)，除由于VP22-EDAG表達(dá)量很低，未獲得純化蛋白質(zhì)外，其余得到相應(yīng)的蛋白質(zhì)，并得到Western-bolt的驗(yàn)證。 本研究系統(tǒng)摸索了PTD融合蛋白質(zhì)表達(dá)、純化、轉(zhuǎn)導(dǎo)等條件，并構(gòu)建了多種PTD-EDAG表達(dá)載體，經(jīng)初步純化獲得Tat-EDAG-Tat融合蛋白質(zhì)，為進(jìn)一步研究