hGITR-PTD-DTA融合蛋白的表達(dá)及其對人肺腺癌A549細(xì)胞株的殺傷作用.pdf

1、目的:
　　 體外表達(dá)linkerl連接的hGITR胞外段、跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTD)和白喉毒素A片段(DTA)重組蛋白(hGITR-PTD-DTA)及其對照蛋白PTD-DTA和hGITR-PTD-eGFP,并研究hGITR-PTD-DTA對人肺腺癌A549細(xì)胞株的殺傷作用。
　　 方法:
　　 (1)首先運(yùn)用PCR擴(kuò)增技術(shù)檢測多種人類腫瘤細(xì)胞細(xì)胞株hGITRLmRNA的表達(dá),流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞株表面GITRL

2、蛋白的表達(dá)。
　　 (2)應(yīng)用PCR技術(shù),以pGEM-T-GITR為模板,擴(kuò)增獲得hGITR胞外段基因；以p22EDT1(含DTA)質(zhì)粒和pUC57質(zhì)粒(含有人工合成的linker和PTD氨基酸序列推算出核苷酸序列并在3'端加上SalⅠ和DTA5’端25個(gè)核苷酸)同時(shí)為模板,擴(kuò)增獲得linker-PTD-DTA基因；以pIRES2-eGFP質(zhì)粒為模板,獲得eGFP基因；對以上擴(kuò)增獲得的目的基因分別進(jìn)行T-A克隆。用BamHⅠ和H

3、indⅢ雙酶切hGITR胞外段基因,用HindⅢ和XhoⅠ雙酶切l(wèi)inker-PTD-DTA基因,用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切原核表達(dá)載體質(zhì)粒pET32a(+),連接酶切產(chǎn)物,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a(+)hGITR-PTD-DTA,轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coli DH5α；同時(shí),用HindⅢ和XhoⅠ雙酶切l(wèi)inker-PTD-DTA基因,和pET32a(+),連接酶切產(chǎn)物,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a(+)PTD—DTA,轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.col

4、iDH5α；分別挑取陽性克隆,經(jīng)雙酶切、PCR和基因測序進(jìn)行鑒定。然后,用SalⅠ和XhoⅠ雙酶切eGFP T-A克隆質(zhì)粒和pET32a(+)hGITR-PTD-DTA,連接酶切產(chǎn)物,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a(-)hGITR-PTD-eGFP,轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH5α；挑取陽性克隆,經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切、PCR和基因測序進(jìn)行鑒定。將構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化ROS表達(dá)工程菌,利用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。
　　

5、 (3)誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白hGITR-PTD-DTA、PTD-DTA和hGITR-PTD-eGFP帶有His標(biāo)簽,分別通過SDS-PAGE和Western blot進(jìn)行鑒定。然后通過Ni+-IMAC柱分別對hGITR—PTD-DTA、PTD-DTA和hGITR-PTD-eGFP進(jìn)行純化。
　　 (4)將對照蛋白hGITR-PTD-eGFP和人肺腺癌A549細(xì)胞株共同孵育,用倒置熒光顯微鏡觀察融合蛋白hGITR-PTD-eGFP和A

6、549細(xì)胞的結(jié)合情況。
　　 (5)采用MTT法測定融合蛋白hGITR—PTD-DTA對腫瘤細(xì)胞的體外殺傷活性,利用人肺癌細(xì)胞A549裸鼠移植瘤模型來評價(jià)融合蛋白hGITR-PTD-DTA對腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)殺傷活性。
　　 結(jié)果:
　　 (1)運(yùn)用PCR擴(kuò)增技術(shù)檢測,發(fā)現(xiàn)有部分人類腫瘤細(xì)胞株hGITRLmRNA表達(dá)陽性,流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)人肺腺癌A549細(xì)胞株表面表達(dá)GITRL蛋白。同時(shí),人肺腺癌A549細(xì)胞株能和

7、hGITR蛋白結(jié)合。
　　 (2)成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pET32a(+)hGITR-PTD-DTA、pET32a(+)PTD—DTA和pET32a(+)hGITR-PTD-eGFP,經(jīng)PCR和雙酶切鑒定分別可見1029bp、675bp和1216bp條帶,測序結(jié)果與預(yù)期完全一致。
　　 (3)將鑒定正確的表達(dá)載體導(dǎo)入ROSI程表達(dá)菌,以終濃度0.5mmol／L IPTG、30℃、誘導(dǎo)6 h作為最佳蛋白誘導(dǎo)條件。利用超聲裂解

8、法裂解菌體,發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)的hGITR—PTD-DTA、PTD-DTA和hGITR-PTD-eGFP融合蛋白有部分是可溶性的。通過SDS-PAGE和Western blot證實(shí)hGITR-PTD-DTA、PTD-DTA和hGITR-PTD-eGFP相對分子量分別約為62kDa,42 kDa和66 kDa。
　　 (4)將對照蛋白hGITR-PTD-eGFP和腫瘤細(xì)胞株A549共同孵育,倒置熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn):融合蛋白hGITR-P

9、TD-eGFP可以和A549細(xì)胞結(jié)合。
　　 (5)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,相對于不表達(dá)hGITRL的K562細(xì)胞來說,融合蛋白hGITR—PTD-DTA對表達(dá)hGITRL的A549細(xì)胞的抑制作用較強(qiáng),對照蛋白PTD-DTA對A549和K562有相對較弱的抑制作用,但hGITR-PTD-eGFP對兩種細(xì)胞都沒有抑制性。融合蛋白hGITR-PTD-DTA對人肺癌細(xì)胞A549裸鼠移植瘤的治療結(jié)果顯示,hGITR-PTD-DTA在劑量為5

10、00μg／kg時(shí)可明顯抑制A549移植瘤的生長。
　　 結(jié)論:
　　 我們研究表明在人類的部分腫瘤細(xì)胞株表面表達(dá)hGITRL蛋白,并且能和GITR蛋白結(jié)合。成功制備可溶性的hGITR—PTD-DTA融合蛋白。對照蛋白hGITR-PTD-eGFP可特異地與人肺腺癌A549細(xì)胞株結(jié)合。在體外培養(yǎng)體系中hGITR-PTD-DTA蛋白對人肺腺癌A549細(xì)胞株具有殺傷作用,在體內(nèi)hGITR—PTD—DTA對人肺腺癌A549裸鼠移植