基于金納米粒的生物分子化學發(fā)光分析新技術.pdf

1、金納米(AuNPs)粒具有優(yōu)良的電學、光學、熱力學與催化性能，已廣泛地應用于物理學、化學、生物學、醫(yī)學和材料科學及其交叉學科。AuNPs毒性小、粒徑小，易于被細胞攝取，經功能化修飾后，可以用于生物成像、藥物與基因傳遞等治療與診斷領域。另外，AuNPs具有卓越的電傳導性、等離子體共振特性和高催化性，且其表面易于修飾，已經廣泛應用于構建光學、電化學等生物傳感器。
　　 化學發(fā)光(CL)分析法是根據(jù)化學反應產生的輻射光的強度來確定物質

2、含量的分析方法。CL分析技術具有分析速度快、靈敏度高、儀器設備簡單、線性范圍廣且適用于微量分析等特性，己廣泛應用于分析化學的各個領域。功能化AuNPs既可用作CL底物的載體；另一方面，由于AuNPs尺寸小、表面效應明顯，因此也具有CL催化劑的作用，如AuNPs可以催化銀離子形成銀原子沉積在AuNPs的表面，同時促進魯米諾自由基的形成，后者可與溶液中溶解的氧反應產生CL信號。因而，AuNPs可以顯著增大CL強度。Luminol-AgNO3

3、-AuNPsCL體系已經用于CL免疫分析、DNA以及有機小分子的含量測定。本論文將AuNPs催化的CL技術與其他技術相結合，發(fā)展了一系列具有創(chuàng)新意義的基于金納米粒的人血漿蛋白、腺苷及端粒酶活性CL分析法。整個論文由以下五個部分組成：
　　 第一章緒論
　　 金納米粒作為一種具有獨特理化性質的貴金屬納米粒子，一直是科學家研究的熱點。本章簡單介紹了金納米粒的合成方法、優(yōu)良性能，并且詳細綜述了金納米粒在藥物與基因傳遞、診斷與成

4、像、生物傳感器以及CL催化等領域中的應用，著重介紹了金納米粒作為一種高效的催化劑在魯米諾CL體系中的重要意義。
　　 第二章基于金納米粒的適配體體系用于IgE的分析
　　 核酸適配體(Aptamers，適配體)是指利用指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術(SELEX)，從隨機單鏈寡聚核苷酸庫中篩選得到的能夠與靶分子特異性結合的單鏈DNA或RNA，已經廣泛應用于臨床治療、診斷與生物技術研究。人免疫球蛋白E(IgE)是五種免疫球蛋白的一

5、種，對過敏反應有著重要的作用。與其他免疫球蛋白不同的是人血漿中IgE的含量極低，但是過敏性哮喘病人體內的IgE含量會升高。本章發(fā)展了基于適配體識別，AuNPs放大體系用于IgE的高選擇性、高靈敏CL分析。本策略主要依賴于固定至聚苯乙烯微孔板上的捕獲抗體、目標蛋白和適配體功能化金納米粒(Apt-AuNPs)三者之間形成“三明治”結構的免疫復合物。只有在加入目標蛋白的情況下，金納米粒才能組裝于微孔板上，組裝成功的AuNPs進而催化魯米諾.硝

6、酸銀CL體系產生CL信號。為了使CL信號進一步放大，隨后在金納米粒表面進行了簡單的氯金酸催化的沉積反應。該CL信號放大技術可使模型蛋白IgE的最低檢測限達到50fM，優(yōu)越于已報道的其他基于適配體的IgE檢測技術。該檢測方法專屬性強，能夠較為理想地分辨出IgE，而不受其它血漿蛋白的干擾，如IgG、IgA和IgM等，已成功應用于35個人血樣中IgE含量的檢測，與對照值相關性良好。綜合而言，該檢測方法具有顯著的優(yōu)點，如最低檢測限能夠達到fM級

7、別、線性范圍廣(跨度達4個數(shù)量級)，可以拓寬至基于適配體的其它蛋白的含量測定，有望在臨床、環(huán)境以及生物防御等領域的目標蛋白高靈敏、高選擇性檢測中獲得應用。
　　 第三章基于適配體-金納米粒識別檢測的血小板衍生化生長因子化學發(fā)光分析新技術
　　 血小板衍生化生長因子(PDGF)可通過與特異的、高親和的細胞膜受體結合促進細胞分裂繁殖。因此，PDGF在血管增生中起著重要的作用，并且與細胞轉化、腫瘤生長及進展存在著密切聯(lián)系。作為

8、PDGF的重要亞型，PDGF-BB在正常細胞中的含量極低，甚至檢測不到。但是在膠質瘤和肉瘤等腫瘤中，PDGF-BB水平會急劇升高。因此，作為一種腫瘤標志物，PDGF-BB的含量測定在癌癥診斷與治療中有著重要的意義。本章發(fā)展了一種新型的、基于適配體識別-金納米標記的CL分析技術，用于。PDGF-BB的高靈敏度檢測。該技術首先將PDGF-BB抗體通過氨基.羧基反應結合至表面具有活性羧基的96孔板上；而生物素標記的PDGF-BB適配體序列，預

9、先組裝于鏈霉親和素金納米粒上形成Apt-AuNPs復合物；在PDGF-BB作用下發(fā)生夾心反應，Apt-AuNPs復合物結合于96孔板上；通過羥胺(NH2OH)與氯金酸(HAuCl4)的氧化還原反應，將96孔板上結合的AuNPs進一步催化放大形成具有更大表面積的粒子，最后采用luminol-AgNO3體系測定其CL信號強度。最優(yōu)條件下，PDGF-BB的線性范圍為0.1～1000 pM(LgI=0.9524LgC+1.4995，R2=0.9

10、883)，檢測限為10fM。此外，專屬性實驗表明：相同濃度的PDGF-AA、PDGF-AB、干擾素a2b及免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM)對PDGF-BB的測定無明顯干擾。綜合而言，本章建立的CL方法能夠簡單、靈敏、高效地檢測PDGF-BB，并有望擴展到其他蛋白的分析。
　　 第四章基于核酸外切酶輔助循環(huán)放大的高靈敏化學發(fā)光傳感器
　　 腺苷作為一種嘌呤核苷，在生物化學上扮演重要角色，包括以腺苷三磷酸或腺苷雙磷酸形式

11、轉移能量，或是以環(huán)狀腺苷單磷酸進行信號傳遞等，此外腺苷也是一種抑制性神經傳導物，可能會促進睡眠。因此，監(jiān)測生理條件下的腺苷水平有著重大的意義。核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)對雙鏈DNA具有高度特異性，能降解平滑末端、3’凹陷末端及有切口的雙鏈DNA，但是不能降解單鏈DNA與3’-突出末端雙鏈DNA。本章我們利用ExoⅢ輔助循環(huán)信號放大技術，構建了新型的AuNPs催化CL適配體傳感器用于腺苷的高靈敏檢測分析。腺苷適配體通過與96孔板上的捕獲探針

12、雜交固定于96孔板上；同時合成報告探針功能化的金納米粒，此AuNPs表面的報告探針與上述腺苷適配體末端部分堿基互補。在腺苷存在的情況下，腺苷適配體會折疊形成雙鏈DNA將腺苷包裹起來，加入ExoⅢ，雙鏈DNA從3’-OH端開始逐漸降解直到腺苷釋放出來，釋放出來的腺苷再次與96孔板上的腺苷適配體結合，降解得到的單鏈DNA由于3’-端降解失去四個堿基，不能夠再與AuNPs表面的DNA堿基形成穩(wěn)定配對，從而影響AuNPs在96孔板上的結合，進而

13、降低所測得的CL信號強度。CL信號減弱強度與腺苷濃度線性相關良好，此法測得腺苷的最低檢測限為0.5 nM，低于文獻報道的其他基于適配體的腺苷檢測方法。該新型CL檢測方法為大量目標物提供了新的檢測方法，為臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測、藥物分析以及生物醫(yī)學研究等提供了一個高效多能的平臺。
　　 第五章基于分子信標.金納米粒的端粒酶活性化學發(fā)光放大檢測技術
　　 端粒酶是一種與許多腫瘤相關的敏感性和特異性的腫瘤標志物。因此，端粒酶活性的

14、快速、靈敏分析對于腫瘤的檢測以及治療方案功效的評價顯得至關重要。本章我們將基于分子信標功能化金納米粒(MB-AuNPs)的CL放大技術應用到人非小細胞肺癌A549細胞中端粒酶活性的檢測。端粒引物在端粒酶與脫氧三磷酸核苷的作用下復制得到靶向DNA。將一端可與96孔板上捕獲DNA發(fā)生堿基配對、另一端生物素修飾的分子信標偶聯(lián)至鏈霉親和素標記的金納米粒上得到MB-AuNPs，此MB-AuNPs上的MB在上述靶向DNA的作用下產生開環(huán)現(xiàn)象，從而將