電化學(xué)免疫傳感器快速檢測(cè)甲型流感病毒的研究.pdf

1、流感病毒長(zhǎng)期威脅人類健康，其中甲型流感病毒每年都會(huì)出現(xiàn)并不斷變異，有時(shí)甚至?xí)?dǎo)致流感疫情大規(guī)模爆發(fā)流行，而防控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一便是通過(guò)檢測(cè)病原體對(duì)流感疑似病例的快速篩查和診斷。現(xiàn)有的病毒分離培養(yǎng)、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法以及熒光定量PCR等檢測(cè)方法在疫情檢測(cè)中發(fā)揮了重要作用，但在時(shí)效性、靈敏度和操作簡(jiǎn)便性方面仍存在不足，不能滿足病原體現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需求。
　　針對(duì)上述需求，本論文以A/Beijing/501/2009甲型H1N1

2、流感病毒為檢測(cè)對(duì)象，于一次性絲網(wǎng)印刷碳電極(SPCE)上構(gòu)建了甲型H1N1流感病毒電化學(xué)免疫生物傳感器(EIS)，探索了流感病毒的電化學(xué)免疫傳感分析檢測(cè)的相關(guān)機(jī)制，建立了甲型H1N1流感病毒電化學(xué)免疫生物傳感檢測(cè)技術(shù)和方法，主要研究結(jié)果如下:
　　(1)對(duì)實(shí)驗(yàn)研究所需的材料，如流感病毒和相應(yīng)的單克隆抗體和HRP標(biāo)記抗體進(jìn)行了培養(yǎng)和收集，并對(duì)這些材料進(jìn)行了驗(yàn)證。用WHO推薦引物經(jīng)RT-PCR驗(yàn)證以及流感病毒AB分型檢測(cè)膠體金試紙條檢

3、測(cè)，結(jié)果表明培養(yǎng)的A/Beijing/501/2009(H1N1)雞胚尿囊液確屬甲型H1N1型流感病毒，血凝實(shí)驗(yàn)測(cè)定其病毒滴度為128HA Unit，證明所培養(yǎng)的A/Beijing/501/2009(H1N1)雞胚尿囊液可以用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。同時(shí)還通過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)考察了所收集到的單克隆抗體A1-24和HRP標(biāo)記單抗A1-6-HRP分別與甲型H1N1型流感病毒的親和力，結(jié)果表明這兩種抗體材料能與甲型H1N1流感病毒形成親和力較高的免疫

4、夾心復(fù)合物，該模式可以用于構(gòu)建甲型H1N1流感病毒電化學(xué)免疫傳感器。
　　(2)考察比較了由不同修飾材料和方法修飾電極的電化學(xué)特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)捕獲抗體經(jīng)物理吸附法固定修飾電極后具有較高的信號(hào)/本底值比、操作步驟簡(jiǎn)單且不需要使用價(jià)格昂貴的納米材料或其他化學(xué)修飾材料，成本低廉，故最終選擇此方法作為捕獲抗體修飾固定電極的方法，并以此構(gòu)建甲型H1N1流感病毒電化學(xué)免疫傳感器。通過(guò)循環(huán)伏安法對(duì)該型免疫傳感器的電化學(xué)行為進(jìn)行了表征，結(jié)果表明該傳感器

5、表面的電活性物質(zhì)主要通過(guò)擴(kuò)散傳質(zhì)方式產(chǎn)生電信號(hào)，在傳感器上產(chǎn)生的電流響應(yīng)信號(hào)與電極上加入的被測(cè)抗原的濃度呈正比關(guān)系，適用于對(duì)被測(cè)抗原進(jìn)行定量測(cè)定。
　　(3)優(yōu)化了影響傳感器檢測(cè)性能的主要工作條件:檢測(cè)中捕獲抗體H1-24和檢測(cè)抗體A1-6-HRP的濃度分別采用400μg/ml和80μg/ml，在此濃度條件下檢測(cè)信號(hào)都比較強(qiáng)，均能達(dá)到最大信號(hào)值的80％以上，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)A(H1N1)流感病毒的靈敏檢測(cè)。孵育最佳溫度均為37℃，在此溫

6、度下抗原抗體反應(yīng)的活性最高，反應(yīng)能快速達(dá)到平衡狀態(tài)，有利于提高反應(yīng)效率。抗原及檢測(cè)抗體的最佳孵育時(shí)間分別為45min和30min，在以上孵育時(shí)間條件下，檢測(cè)的靈敏度均較高，經(jīng)過(guò)優(yōu)化后該免疫傳感器的檢出時(shí)間縮短至2h以內(nèi)，比傳統(tǒng)的ELISA法整體測(cè)定時(shí)間減少了1～2h，利用這種新型傳感器能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)A(H1N1)流感病毒的快速檢測(cè)。
　　(4)建立了電化學(xué)免疫傳感器測(cè)定甲型H1N1流感病毒的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以及測(cè)定甲型H1N1流感病毒相應(yīng)的

7、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)標(biāo)準(zhǔn)曲線和熒光定量法(qPCR)標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于對(duì)傳感器各項(xiàng)檢測(cè)性能指標(biāo)進(jìn)行考察。針對(duì)A(H1N1)流感病毒的檢測(cè)信號(hào)與針對(duì)甲型H7N9、H3N2、B型流感病毒、EV71以及腺病毒等陰性對(duì)照的信號(hào)的統(tǒng)計(jì)分析檢驗(yàn)結(jié)果表明，該傳感器的特異性良好。重復(fù)性測(cè)定結(jié)果顯示該傳感器的RSD＜10％，回收率為80％～110％，呈現(xiàn)出較高的準(zhǔn)確度和精密度。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該傳感器儲(chǔ)存10天內(nèi)檢測(cè)信號(hào)幾乎不下降，30天后的測(cè)定值

8、也能保持在85％以上，具有較好的存儲(chǔ)穩(wěn)定性。EIS法的檢測(cè)下限可達(dá)0.41 HA Unit，與ELISA法相當(dāng)，并能對(duì)4～64HA Unit范圍內(nèi)的甲型H1N1流感病毒實(shí)現(xiàn)定量測(cè)定，且EIS的總體假陽(yáng)性率為10.0％，優(yōu)于ELISA法。所建立的EIS法與qPCR的測(cè)定結(jié)果的相關(guān)系數(shù)為0.9517，說(shuō)明EIS法定量的準(zhǔn)確度能達(dá)到與qPCR一致的水平。
　　(5)最后應(yīng)用微型化的Emstat電化學(xué)檢測(cè)設(shè)備，基于便攜的陣列化電極以甲型H