過度訓(xùn)練誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制及活血化瘀藥物干預(yù)的研究.pdf

1、目的：過度訓(xùn)練引起的心肌損傷(overtraining-induced acute myocardialinjury，OTIAMI)是猝死的重要原因之一，目前臨床上尚缺乏有效的防治措施。因此，如何進(jìn)一步認(rèn)識OTIAMI的發(fā)病機(jī)制，探索其防治措施是目前運動醫(yī)學(xué)、軍事醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)面臨的重大課題。但以往的研究多局限于形態(tài)和功能的探討，而對引起心肌損傷的分子機(jī)制缺乏系統(tǒng)研究，這就影響了對OTIAMI發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識和防治措施的探索。最近研究發(fā)現(xiàn)

2、，心肌細(xì)胞凋亡在OTIAMI中發(fā)揮重要作用。但有關(guān)OTIAMI時心肌細(xì)胞凋亡機(jī)制以及細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要途徑尚不清楚。藥物篩選研究表明，山莨菪堿具有抗心肌缺血再灌注損傷，減輕 TNF-α所致的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡；旋覆花素可通過抑制炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑影響細(xì)胞的凋亡；苦碟子具有清除自由基抗氧化作用；這三種藥物對各種原因引起的組織缺血缺氧具有拮抗作用，但它們能否干預(yù)過度訓(xùn)練所致的急性心肌損傷值得探討。本研究通過讓大鼠游泳至力竭，建立大鼠過度訓(xùn)練致急性

3、心肌損傷模型，研究過度訓(xùn)練引起心肌損傷的特征，闡明心肌損傷過程中心肌細(xì)胞凋亡機(jī)制及Caspase 凋亡相關(guān)信號傳導(dǎo)通路的作用，觀察山莨菪堿、旋覆花素和苦碟子對OTIAMI的防治作用，以期加深對OTIAMI分子發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識，為臨床OTIAMI的防治提供新的實驗依據(jù)和措施。 方法：將80只雄性Wistar 大鼠(體重200～220g)隨機(jī)分為安靜對照組(control，CN，n=8)、力竭運動組(exllaustive swimm

4、ing，ES，n=24)、山莨菪堿干預(yù)組(Anisodalnine，AD，n=16)、旋覆花素干預(yù)組(InulaBritannica，IB，n=16)、苦碟子干預(yù)組(Ixeris Sonchifolia，IS，n=16)。CN 組為安靜對照；ES組又根據(jù)力竭后恢復(fù)時間分為力竭后即刻(ESI)、力竭后6h(ES 6h)和力竭后24h(ES 24h)；AD組于力竭運動前20min腹腔注射山莨菪堿10 mg/kg后進(jìn)行力竭運動，分為AD 6h

5、和AD 24h組：IB組于力竭運動前24h分三次口腔灌入旋覆花素25ml/kg (含ABL65mg/kg/d)后進(jìn)行力竭運動，分為IB 6h和IB 24h組；IS組于力竭運動前20min腹腔注射苦碟子注射液20g/kg(含總黃酮8mg/kg和腺苷0.05mg/kg)后進(jìn)行力竭運動，分為IS 6h和IS 24h組。每個時間點8只大鼠。采用游泳力竭法建立大鼠過度訓(xùn)練致急性心肌損傷模型，于實驗結(jié)束時分別檢測各組大鼠血清磷酸肌酸激酶(CK)及磷

6、酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)，心肌組織結(jié)構(gòu)的改變和心肌細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因表達(dá)的變化；比較不同藥物處理對力竭致心肌損傷的防治作用和對心肌細(xì)胞凋亡的干預(yù)影響。實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，用SPSS 12.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，組間差異用單因素方差分析，以P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： 1 過度訓(xùn)練致大鼠心肌細(xì)胞凋亡及山茛菪堿、旋覆花素、苦碟子的影響 為了探討過度訓(xùn)練引起心肌損傷的特征，闡明心

7、肌細(xì)胞凋亡在過度訓(xùn)練致心肌損傷過程中的作用，尋求防治 OTIAMI 的藥物，本部分實驗觀察了過度訓(xùn)練大鼠心肌形態(tài)、功能和代謝的變化及山莨菪堿、旋覆花素、苦碟子干預(yù)的影響。實驗結(jié)果如下： 1.1 血清CK及CK-MB的變化：血清CK及CK-MB水平是評價心肌損傷的重要指標(biāo)。與對照組相比，力竭后即刻、力竭后6h大鼠血CK及CK-MB明顯升高(P<0.05)，且力竭后6h明顯高于力竭后即刻大鼠(P<0.05)；力竭后24h大鼠血CK及

8、CK-MB均恢復(fù)到對照組水平(P>0.05)。山莨菪堿、旋覆花素及苦碟子組大鼠力竭后6h與同期力竭組比較，血CK及CK-MB明顯降低(P<0.05)，三種藥物之間比較無明顯差別。結(jié)果提示，過度訓(xùn)練可導(dǎo)致心肌細(xì)胞的損傷，上述三種藥物可減輕這種變化。因此，本實驗又觀察了心肌形態(tài)的變化。 1.2 心肌形態(tài)的變化：HE 染色發(fā)現(xiàn)，力竭后即刻大鼠僅見部分心肌纖維腫脹肥大，偶見心肌間血管及毛細(xì)血管擴(kuò)張，力竭后6h及24h可見部分心肌細(xì)胞的細(xì)

9、胞核深染，有固縮現(xiàn)象。山莨菪堿、旋覆花素、苦碟子組大鼠力竭后6h及24h心肌形態(tài)的變化明顯減輕。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，力竭后即刻、6h及24h大鼠均可見心肌細(xì)胞核周圍和肌纖維明顯水腫，核內(nèi)染色質(zhì)也明顯水腫，肌纖維中細(xì)胞器數(shù)量明顯減少，線粒體部分水腫，部分嵴排列紊亂，部分嵴和膜融合或消失，糖原數(shù)量顯著減少。 1.3 血清和心肌組織中SOD及MDA 的變化：氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)是心肌缺血再灌注損傷的重要機(jī)制。本研究結(jié)果表明，力竭后不同時間大鼠血

10、清和心肌組織SOD呈一過性降低，于力竭后6h達(dá)最低值(P<0.05)，MDA則呈相反趨勢變化，兩種指標(biāo)于力竭后24h恢復(fù)達(dá)對照水平。山莨菪堿、旋覆花素及苦碟子對力竭所致的SOD水平降低和MDA水平升高具有逆轉(zhuǎn)作用。結(jié)果說明，過度訓(xùn)練可引起大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，三種藥物均有明顯的抗氧化作用，進(jìn)而對心肌起到明顯的保護(hù)作用。 2 過度訓(xùn)練致大鼠心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)及山莨菪堿、旋覆花素、苦碟子干預(yù)的影響 為了探討力竭所致的心

11、肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制，本研究進(jìn)一步觀察了力竭及藥物干預(yù)下心肌組織凋亡相關(guān)基因表達(dá)的變化。結(jié)果顯示，力竭后即刻和6h組大鼠心肌Bax的表達(dá)水平進(jìn)行性增強(qiáng)(P<0.05)，Bcl-2 的表達(dá)水平則表現(xiàn)相反的進(jìn)行性減弱(P<0.05)，Bax/Bcl-2比值增高(P<0.05)；力竭后24h組大鼠心肌Bax和Bcl-2的表達(dá)水平逐漸恢復(fù)并接近至對照水平(P<0.05)。應(yīng)用山莨菪堿、旋覆花素、苦碟子6h組大鼠與同期力竭組比較，心肌組織：Bax的表

12、達(dá)減弱(P<0.05)，Bcl-2的表達(dá)增高(P<0.05)，Bax/Bcl-2比值降低(P<0.05)，山莨菪堿和旋覆花素使Bax/Bcl-2比值降低比苦碟子更為明顯(P<0.05)：應(yīng)用山莨菪堿、旋覆花素、苦碟子24h組大鼠與同期力竭組比較，心肌組織 Bax 的表達(dá)減弱(P<0.05)，Bcl-2的表達(dá)增高(P<0.05)，Bax/Bcl-2 比值降低(P<0.05)。各組大鼠心肌組織Bax/Bcl-2 比值與心肌細(xì)胞凋亡率呈明顯正

13、相關(guān)性(r=0.727，P<0.01)。 結(jié)果表明，過度訓(xùn)練可使心肌Bax和Bcl-2比例失衡，進(jìn)而導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡；三種藥物可通過調(diào)整凋亡相關(guān)基因表達(dá)的平衡而阻止過度訓(xùn)練誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。 3 Caspase 凋亡相關(guān)信號傳導(dǎo)通路在過度訓(xùn)練致大鼠心肌細(xì)胞凋亡中的作用 為了探討過度訓(xùn)練誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的信號通路，本研究用免疫組化和流式細(xì)胞術(shù)分析檢測了一組凋亡相關(guān)信號分子在力竭后不同時間的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，力竭

14、后即刻心肌組織中TNF-α、Caspase-8、Caspase-9和Bid蛋白的表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.05)，力竭后6h心肌組織四種蛋白的表達(dá)明顯高于力竭后即刻和對照組(P<0.05)，力竭后24h這些蛋白在心肌組織中的表達(dá)明顯低于力竭后6h組(P<0.05)，但仍明顯高于力竭后即刻和對照組(P<0.05)。與上述四種凋亡相關(guān)信號分子不同的是心肌NF-κB的變化，在力竭后不同時間，大鼠心肌組織中NF-κB 表達(dá)呈進(jìn)行性升高，持續(xù)到力竭后

15、24h，且各組之間均具有顯著性差異(P<0.05)。心肌組織中Fas-L 的變化趨勢與TNF-α等蛋白的表達(dá)水平基本相似，只是在力竭后24h下降幅度不及TNF-α。結(jié)果表明，TNF-α、NF-κB、Fas-L、Caspase-8、Caspase-9和Bid蛋白參與介導(dǎo)力竭所致的心肌細(xì)胞凋亡；同時也反映出短暫力竭只引起凋亡相關(guān)蛋白的瞬時表達(dá)改變。提示短時間力竭所致的心肌損傷具有可逆性，可在較短時間內(nèi)恢復(fù)，這為藥物防治提供了有利時機(jī)。

16、 4 山莨菪堿、旋覆花素、苦碟子對過度訓(xùn)練大鼠心肌 Caspase 相關(guān)凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響 為了確定山莨菪堿、旋覆花素、苦碟子逆轉(zhuǎn)力竭誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡是否與干預(yù)凋亡相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，繼而觀察了三種藥物對Caspase相關(guān)信號分子表達(dá)的影響。結(jié)果表明，給予三種藥物的大鼠在力竭后6h和24h檢測到的TNF-α、NF-κB、Fas-L、Caspase-8、Caspase-9和Bid蛋白水平均較未用藥組明顯降低(P<0.05)，

17、但尚未恢復(fù)到對照水平。在作用強(qiáng)度上，山莨菪堿和旋覆花素的效果比苦碟子更顯著。結(jié)果提示，三種藥物可不同程度消弱凋亡信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。 結(jié)論： 1 游泳所致短暫力竭可引起心肌細(xì)胞凋亡與損傷，但病變較輕，機(jī)體可在短時間內(nèi)使受損心肌得到修復(fù)。結(jié)果提示，及時采取藥物干預(yù)是OTIAMI防治的關(guān)鍵。 2 力竭誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡與其破壞Bax/Bcl-2 平衡、上調(diào)Caspase相關(guān)信號蛋白的表達(dá)、強(qiáng)化凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。 3