缺氧-復(fù)氧誘導(dǎo)肥大的心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究.pdf

1、背景:缺血/再灌注(Ischemia/reperfusion，I/R)損傷是心肌梗死、心肺旁路術(shù)和心臟移植的一個(gè)主要并發(fā)癥。既往認(rèn)為缺血/再灌注損傷中的心肌細(xì)胞死亡主要是細(xì)胞壞死。然而近年來研究證實(shí)心肌細(xì)胞凋亡在心肌缺血/再灌注中的細(xì)胞死亡中起重要作用而且可能是反復(fù)缺血后肥大心肌向心力衰竭轉(zhuǎn)變的重要機(jī)制。目前缺血/再灌注損傷中的肥大心肌細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制仍不清楚。線粒體功能障礙與心肌再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，因?yàn)榫€粒體的主要功能是能

2、量代謝，在心肌細(xì)胞中極為豐富，同時(shí)它又是促凋亡分子的主要來源。 線粒體通過釋放細(xì)胞色素c至胞漿而誘發(fā)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，隨后使caspase-3活化，最后導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。這是caspase依賴性細(xì)胞死亡途徑。因此有人研究了caspase-3抑制劑能否通過減輕心肌細(xì)胞凋亡而降低心肌缺血/再灌注損傷的程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)caspase-3抑制劑并不能降低心肌梗死的面積。這提示細(xì)胞色素caspase-3在缺血/再灌注中的作用還有待進(jìn)

3、一步明確，同時(shí)提示除此之外可能還有其它的凋亡途徑參與缺血/再灌注損傷中的心肌細(xì)胞凋亡過程。近年來發(fā)現(xiàn)凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)是存在于線粒體膜間隙中一種促凋亡分子。受凋亡刺激時(shí)AIF從線粒體中釋放至并轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。caspase抑制劑不能抑制AIF的促凋亡作用，也即AIF介導(dǎo)了caspase非依賴性的細(xì)胞凋亡途徑。然而AIF在心肌細(xì)胞凋亡中的作用仍不清楚。另一方面，作為線粒體功能障礙之一的代謝途徑改變與心肌細(xì)胞損傷有關(guān)。二

4、氯乙酸、抗霉素A、曲美他嗪和L-肉堿可直接或間接影響葡萄糖氧化和脂肪酸氧化，同時(shí)它們具有抗凋亡或促凋亡作用。因此能量代謝途徑改變也可能在心肌細(xì)胞凋亡中起重要作用。目前仍不清楚能量代謝途徑改變是否與細(xì)胞色素c、AIF有關(guān)。 目的:1.觀察缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)肥大心肌細(xì)胞凋亡的作用，探討兩者間的關(guān)系。 2.觀察細(xì)胞色素c表達(dá)、caspase-3活性變化及caspase-3抑制劑對(duì)凋亡的影響，探討caspase依賴性途徑在缺氧/復(fù)氧

5、后肥大心肌細(xì)胞凋亡中的作用。 3.觀察AIF表達(dá)變化及AIFsiRNA轉(zhuǎn)染對(duì)凋亡的影響，探討AIF介導(dǎo)的caspase非依賴性途徑在缺氧/復(fù)氧后肥大心肌細(xì)胞凋亡中的作用。 4.觀察干預(yù)能量代謝后細(xì)胞凋亡的變化、細(xì)胞色素c和AIF表達(dá)變化及caspase-3活性變化，探討代謝途徑改變?cè)谌毖?復(fù)氧后肥大心肌細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制。 方法:1.模型建立及缺氧及復(fù)氧與肥大心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)系：采用胰酶消化法、差速貼壁法、阿

6、糖胞苷加入法分離、純化1-2d新生昆明系小鼠心肌細(xì)胞。分離的心肌細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM/F12。α-Sacromericactin免疫細(xì)胞化學(xué)法及電鏡鑒定心肌細(xì)胞；AngⅡ刺激48h誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，Bradford法及[3H]-亮氨酸摻入法分別測(cè)定總蛋白含量和蛋白質(zhì)合成速率。以缺氧(5％的二氧化碳，95％氮?dú)?+低糖DMEM、復(fù)氧模擬缺血/再灌注誘導(dǎo)肥大心肌細(xì)胞凋亡，用電鏡法鑒定凋亡細(xì)胞，TUNEL染色法和Hoechst33258染色法觀

7、察缺氧8h、12h及缺氧/復(fù)氧4h時(shí)的凋亡規(guī)律。 2.caspase依賴性途徑在缺氧及復(fù)氧后肥大心肌細(xì)胞凋亡中的作用：于缺氧8h、12h及缺氧/復(fù)氧4h時(shí)，westernblot法檢測(cè)細(xì)胞色素c蛋白表達(dá)及胞漿轉(zhuǎn)位。RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞色素cmRNA表達(dá)。比色法檢測(cè)caspase-3活性。JC-1染色法觀察了缺氧、復(fù)氧時(shí)線粒體膜電位變化。檢測(cè)了caspase-3抑制劑對(duì)缺氧12h及缺氧12h/復(fù)氧4h時(shí)細(xì)胞凋亡的影響(Hoech

8、st33258染色法)。 3.AIF在缺氧及復(fù)氧后肥大心肌細(xì)胞凋亡中的作用：于缺氧8h、12h及缺氧/復(fù)氧4h時(shí)，westernblot法檢測(cè)AIF蛋白表達(dá)及核轉(zhuǎn)位。RT-PCR法檢測(cè)AIFmRNA表達(dá)。觀察了AIF小干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)轉(zhuǎn)染對(duì)缺氧12h及缺氧12h/復(fù)氧4h后肥大心肌細(xì)胞凋亡的影響。westernblot法及RT-PCR法檢測(cè)了AIFsiRNA轉(zhuǎn)染致AIF基因沉默的效

9、率。 4.干預(yù)代謝途徑對(duì)缺氧/復(fù)氧時(shí)肥大心肌細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制：用改變糖代謝、脂肪酸代謝的試劑二氯乙酸、抗霉素A、曲美他嗪和L-肉堿干預(yù)后，觀察了缺氧12h及缺氧12h/復(fù)氧4h時(shí)肥大心肌細(xì)胞凋亡的變化(Hoechst33258染色法)，westernblot法檢測(cè)細(xì)胞色素c胞漿轉(zhuǎn)位及AIF核轉(zhuǎn)位變化，RT-PCR法檢測(cè)兩者的mRNA變化。 結(jié)論:1.采用胰酶消化法、差速貼壁法及Ara-C加入法及AngⅡ刺激法成功地進(jìn)

10、行了新生小鼠肥大心肌細(xì)胞體外培養(yǎng)。缺氧可誘導(dǎo)肥大心肌細(xì)胞凋亡，復(fù)氧可進(jìn)一步加強(qiáng)細(xì)胞凋亡，缺氧/復(fù)氧是研究肥大心肌細(xì)胞凋亡的理想模型. 2.缺氧及缺氧/復(fù)氧時(shí)肥大心肌細(xì)胞細(xì)胞色素cmRNA、蛋白表達(dá)及胞漿轉(zhuǎn)位增加、caspase-3活性增加，而抑制caspase-3活性可顯著降低缺氧及缺氧/復(fù)氧時(shí)肥大心肌細(xì)胞凋亡。提示：caspase依賴性細(xì)胞死亡途徑是缺氧及缺氧/復(fù)氧時(shí)肥大心肌細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制之一。 3.缺氧/復(fù)氧時(shí)肥

11、大心肌細(xì)胞AIFmRNA、蛋白表達(dá)及核轉(zhuǎn)位增加，而且其核轉(zhuǎn)位不受caspase抑制劑的影響。AIFsiRNA轉(zhuǎn)染可抑制心肌細(xì)胞AIF蛋白及mRNA表達(dá)，著減輕缺氧/復(fù)氧時(shí)肥大心肌細(xì)胞凋亡。提示：AIF介導(dǎo)的caspase非依賴性的細(xì)胞死亡途徑也參與缺氧/復(fù)氧時(shí)肥大心肌細(xì)胞凋亡過程。 4.二氯乙酸、曲美他嗪、L-肉堿具有抗細(xì)胞凋亡作用，并伴隨著細(xì)胞色素c、AIFmRNA表達(dá)及蛋白的轉(zhuǎn)位降低，caspase-3活性降低，而抗霉素A有