干預(yù)代謝途徑對(duì)缺血再灌注誘導(dǎo)肥大心肌細(xì)胞凋亡作用的研究.pdf

1、目的:近年來(lái)研究認(rèn)為線粒體能量代謝在細(xì)胞凋亡中起到重要的作用,但其作用機(jī)制欠清楚,尤其是對(duì)于肥大心肌細(xì)胞凋亡及其能量干預(yù)影響鮮有報(bào)道.本研究引入改變糖代謝、脂肪代謝的試劑二氯乙酸鹽(dichloroaceetate),抗霉素A(antimycin A)、曲美他嗪(trimetazidine)、L-肉堿(L-carnitine)等干預(yù),研究其對(duì)缺氧-復(fù)氧致肥大心肌細(xì)肥凋亡作用的影響,試圖闡明線粒體代謝途徑的轉(zhuǎn)變與肥大心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)系,即

2、干預(yù)代謝途徑對(duì)肥大心肌細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用.材料與方法:該研究采用胰酶分步消化法進(jìn)行Wistar大鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng),用差速黏附技術(shù)加Brdu法除去非心肌細(xì)胞.采用特異性免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法及電鏡鑒定體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞,含血管緊張素AII10-7mol/L的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞48h誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大.應(yīng)用[<'3>H]-亮氨酸摻入測(cè)定心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成速率來(lái)檢測(cè)心肌肥大及透射電鏡觀察肥大心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化.以低氧飽和的低糖DMEM培養(yǎng)基置換原

3、高糖DMEM培養(yǎng)基后,細(xì)胞放入37℃的3﹪氧氣(3﹪O<,2>),5﹪二氧化碳(5﹪CO<,2>,),92﹪氮?dú)?92﹪N<,2>,)孵箱中,在此缺氧條件下培養(yǎng)12h~48h,再放回原DMDM培養(yǎng)基5﹪CO<,2>,22﹪O<,2>孵箱中4h,通過(guò)體外缺氧、復(fù)氧的方式在細(xì)胞水平模擬心肌缺血再灌注損傷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.用電鏡鑒定凋亡細(xì)胞,用可與細(xì)胞核DNA結(jié)合的熒光染料Hoechst33342/PI雙染法識(shí)別凋亡細(xì)胞,用TUNEL末端標(biāo)記法研

4、究凋亡規(guī)律,提取細(xì)胞DNA用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)具有凋亡特征的DNA梯形帶.用改變糖代謝的試制二氯乙酸鹽、抗霉素A和改變脂肪代謝的試制曲美他嗪、L-肉堿等不同劑量干預(yù),觀察對(duì)缺氧/復(fù)氧不同時(shí)相點(diǎn)誘導(dǎo)體外培養(yǎng)肥大心肌細(xì)胞凋亡作用的影響.用SPSS10.0行統(tǒng)計(jì)分析.結(jié)果:1.原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞呈梭形、三角形及不規(guī)則形.其中,梭形細(xì)胞占培養(yǎng)細(xì)胞的80﹪左右,胞體呈細(xì)長(zhǎng)的梭形,呈圓形,胞質(zhì)折光性強(qiáng),搏動(dòng)明顯.小鼠特異性抗大鼠a-心肌肌動(dòng)蛋白免疫

5、細(xì)胞化學(xué)染色,可見(jiàn)胞漿中大量棕紅色絲狀陽(yáng)性著色,胞核不著色.2.與對(duì)照組比較,AngII組超微結(jié)構(gòu)改變表現(xiàn)為:心肌細(xì)胞胞核及核仁增大,胞核形態(tài)不規(guī)則,染色質(zhì)豐富,粒體腫脹,胞質(zhì)中糖原及脂質(zhì)沉著.這些改變符合代償性細(xì)胞肥大表現(xiàn).3.AngII組心肌細(xì)胞[<'3>H]-亮氨酸摻入較對(duì)照組明顯增強(qiáng),提示細(xì)胞肥大、蛋白質(zhì)合成增強(qiáng).4.單純?nèi)毖蹩蓪?dǎo)致體外培養(yǎng)的肥大心肌細(xì)胞凋亡,隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng),凋亡率增加.5.缺氧/復(fù)氧可導(dǎo)致體外培養(yǎng)的肥大心肌細(xì)

6、胞凋亡,缺氧/復(fù)氧比單純?nèi)毖醺艽龠M(jìn)心肌細(xì)胞凋亡.6.二氯乙酸、曲美他嗪、L-肉堿呈劑量依賴性明顯降低細(xì)胞凋亡率(P<0.01).7.抗霉素A呈劑量依賴性明顯升高細(xì)胞凋亡率(P<0.01).結(jié)論:1.采用膠原酶分步消化培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞具有簡(jiǎn)便易行、細(xì)胞產(chǎn)量高、損傷小的優(yōu)點(diǎn),是研究心肌肥厚的細(xì)胞模型的重要手段和工具.2.AngII可明顯促進(jìn)心肌細(xì)胞增生及結(jié)構(gòu)蛋白的生物合成,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生肥大的病理改變.3.二氯乙酸、曲美他嗪、L-肉堿具