應(yīng)力刺激下VEGF緩釋劑促進組織工程骨血管生成與成骨的實驗研究.pdf

1、背景和目的：目前應(yīng)用組織工程骨(tissue engineering bone，TEB)修復(fù)大段骨缺損時，其成骨效能低、愈合時間長，甚至出現(xiàn)延遲愈合和不愈合，使修復(fù)歸于失敗，其主要原因是大塊TEB植入體內(nèi)早期營養(yǎng)攝取不足，種子細胞活力下降甚至凋亡，中、晚期新生的骨痂塑形、改建所需時間長。血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascular endothelialgrowth factor，VEGF)在血管再生中起著重要作用，但在體內(nèi)的半衰期短，直接應(yīng)

2、用療效差，須制備VEGF緩釋劑以最大限度地提高其生物學(xué)作用。此外，研究表明周期性應(yīng)力刺激能加快新生骨痂的塑形、改建，促進骨愈合，但是這種周期性應(yīng)力刺激能否促進組織工程骨的愈合需要進一步研究。為此，本實驗主要目的包括(1)制備出具有良好緩釋特性的VEGF/藻酸鹽微球，并將微球與ECs、MSCs共培養(yǎng)，觀察其對離體ECs的增殖作用及對MSCs增殖與分化的影響；(2)通過對羊股骨解剖學(xué)參數(shù)測定，研制出微動型交鎖髓內(nèi)釘，建立了新型羊股骨段狀骨缺

3、損模型；(3)利用該模型研究應(yīng)力刺激下VEGF/藻酸鹽微球?qū)EB的血管生成與成骨作用的影響。 方法：(1)采用滴出法制備VEGF/藻酸鹽微球，用雙抗體夾心法測定其包封率、突釋率及釋放時間；(2)用MTT法、流式細胞儀、免疫組織化學(xué)、RT-PCR等技術(shù)觀察其對離體ECs和MSCs的增殖及對MSCs成骨誘導(dǎo)分化的影響；(3)研制周期性應(yīng)力刺激儀，并監(jiān)測VEGF/藻酸鹽微球在應(yīng)力刺激下的釋放特性；(4)在對羊股骨解剖學(xué)參數(shù)測定的基礎(chǔ)

4、上，研制微動交鎖髓內(nèi)釘固定系統(tǒng)，利用生物力學(xué)、X線攝片等技術(shù)在體內(nèi)、外測量微動性能和力學(xué)強度；(5)用研制的微動交鎖髓內(nèi)釘創(chuàng)建新型羊股骨段狀骨與骨膜缺損模型，通過大體觀察、X線攝片、組織病理學(xué)和生物力學(xué)評估其科學(xué)性與可行性；(6)制備同種異體的羊DBM，應(yīng)用掃描電鏡、生物物理學(xué)和生物力學(xué)等方法檢測了其理化特性和生物力學(xué)特征；(7)用同種異體羊DBM與自體MSCs構(gòu)建TEB，通過基因轉(zhuǎn)染熒光標(biāo)記、激光共聚焦成像及掃描電鏡技術(shù)觀察了MSCs

5、在DBM上生長、增殖及體內(nèi)的成活情況；(8)利用放射性核素骨顯像、墨汁灌注、組織病理學(xué)、免疫組織化學(xué)定性與定量評估在周期性應(yīng)力刺激下，VEGF/藻酸鹽微球?qū)EB血管生成的效果；(9)應(yīng)用X線評分，雙能X線分析、組織病理學(xué)和生物力學(xué)測試等方法進一步評估在周期性應(yīng)力刺激下，VEGF/藻酸鹽微球?qū)EB成骨愈合的的促進作用。 結(jié)果：(1)應(yīng)用滴出法成功制備了VEGF/藻酸鹽微球，載藥量為(8.70±0.63)ng/mg，包封率為(8

6、7.0±3.3)％，釋放時間為(16.1±1.3)d；(2)密度為0.2mg/ml、2mg/ml的VEGF/藻酸鹽微球均使ECs的S和G2期增多，生長曲線前移，峰值增高；(3)根據(jù)所測羊的步頻(81.5±4.0)次/分，負重壓力(22.7±8.2)Kg等參數(shù)，研制了周期性應(yīng)力刺激儀，其參數(shù)范圍：壓縮頻率為60～150次/分，沖頭位移距離0～3mm，壓縮時間0～10h。(4)用刺激頻率80次/分，壓縮幅度為1.5mm，刺激總時間為6h作用

7、于VEGF/藻酸鹽微球，早期可一定程度上促進VEGF'的釋放，7天后，這種促進作用逐漸減小并消失。(5)第3代羊MSCs CD44+CD29陽性表達為93.6％、CD45為1.58％、CD<,62>為1.0％，密度為0.2mg/ml、2mg/ml的VEGF/藻酸鹽微球與MSCs具有良好的生物相容性，細胞周期和增殖分數(shù)無明顯改變，混合培養(yǎng)的MSCs可形成鈣結(jié)節(jié)，表達骨鈣素、成骨誘導(dǎo)基因cbfa-1和Ⅰ型膠原，定量檢測堿性磷酸酶(ALP)活

8、性也未受影響；(6)羊股骨與人的股骨形態(tài)相近似，長度平均(13.30±0.56)cm，其前曲度平均(9.0±1.3)°，近、遠端髓腔直徑與中段髓腔直徑差別不明顯(P>0.05)；(7)研制的微動交鎖髓內(nèi)釘系統(tǒng)經(jīng)體內(nèi)、外的微動性能測試，證實其隨著壓力增大微動范圍也隨之增大，但最大微動范圍<1.5mm，最大抗壓強度均在5000N以上，超過羊體重的20倍；(8)創(chuàng)建的山羊股骨2cm骨與骨膜缺損的動物模型，經(jīng)24周觀察骨折端為纖維瘢痕組織充填，

9、股骨力線正常，無明顯的側(cè)彎，扭轉(zhuǎn)、成角現(xiàn)象，4枚鎖釘均位于髓孔內(nèi)，無折斷和退釘；(9)制備的羊DBM孔隙度較高(63±2.1)％、孔徑大(413.3±41.7)μm、最大吸水率(417.7±44.4)％、具有良好的形變與形變恢復(fù)能力；(10)體外構(gòu)建的TEB的MSCs黏附率達(9l±8.2)％，經(jīng)28d觀察，EGFP標(biāo)記的MSCs可在體內(nèi)生長、增殖；(11)放射性核素骨顯像顯示術(shù)后4、8周實驗組的T/NT比值分別為4.33±0.25、1

10、1.09±0.50，均高于各對照組(p<0.05)，墨汁灌注及組織病理學(xué)，Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組織化學(xué)染色均顯示，與對照組相比，實驗組的TEB血管呈網(wǎng)狀分布，排列規(guī)律，管徑大小相對較一致；(12)術(shù)后12、16周x線評分實驗組為4.95±0.413和5.36±0.51，BMD值分別為(1.37±0.08)g/cm<'2>和(1.68+0.18)g/cm<'2>，術(shù)后16周極限扭力到正常83％，均明顯高于各對照組(p<0.05)。

11、結(jié)論：(1)制備的VEGF/藻酸鹽微球具有良好的載藥量、包封率和緩釋性能，不同密度VEGF/藻酸鹽微球可明顯地促進離體ECs的增殖；(2)研制了周期性應(yīng)力刺激儀，觀察到周期性應(yīng)力刺激可一定程度促進VEGF/藻酸鹽微球的早期釋放；(3)密度為0.2mg/ml、2mg/ml的vEGF/藻酸鹽微球均與MSCs具有良好的生物相容性，對其增殖、分化無明顯影響；(4)研制的微動交鎖髓內(nèi)釘固定系統(tǒng)，經(jīng)體內(nèi)、外測試，其微動性能良好，最大微動范圍<1.5