血管化組織工程骨修復獼猴脛骨缺損的實驗研究.pdf

1、目的：我們曾采用血管化組織工程骨修復大動物(山羊)20mm脛骨缺損，獲得了確切的修復效果。為了進一步為臨床試驗提供更詳細、可行的方法，我們選取獼猴為實驗動物，在進行解剖觀察后，提出了進一步的血管化方法，通過對支架外型的特殊設計，允許血管和筋膜兩種血管化方法的并存和協(xié)同，這樣不僅加快了組織工程骨的血管化進程，而且對成骨質(zhì)量的提高和時限的縮短等有了明顯的作用效果。 本實驗目的在于檢測獼猴骨髓基質(zhì)干細胞與β-磷酸三鈣的組織相容性，建立

2、可行的組織工程骨修復獼猴脛骨段性缺損的動物模型，檢測組織工程骨體內(nèi)血管化程度和成骨情況，探究血管化程度與成骨質(zhì)量的關系。 方法： 第一部分：取傳三代獼猴骨髓基質(zhì)細胞與材料復合培養(yǎng)，將獼猴BMSC與β-TCP復合培養(yǎng)，單純細胞組作對照。所取樣本使用倒置相差顯微鏡，掃描電鏡觀察兩組細胞形態(tài)及增殖情況，MTT法半定量檢測細胞增殖情況。 第二部分：對一只自然死亡的獼猴進行新鮮解剖，觀察其脛骨的形態(tài)及周圍知名血管束的解剖路

3、徑；將11只獼猴雙側脛骨(共22處)制成中段20mm骨-骨膜缺損，隨機平均分成2組(實驗組和對照組各9側)，實驗組在缺損處填塞由骨髓基質(zhì)干細胞(BMSCs)和具有特殊外型(側槽和中空管)的β-磷酸三鈣(β-TCP)支架體外構建的復合物，在中空管內(nèi)移入隱動、靜脈束的一段，工程骨外被帶蒂深筋膜；對照組只填塞組織工程骨。另外2只獼猴的無填充物脛骨缺損作空白對照。鋼板螺釘固定。在4、8、12周時間點分別行放射線檢測，墨汁灌注標本，組織學檢測及標

4、本大體觀察。 第三部分：將20只獼猴雙側脛骨(共40處)制成中段20mm骨-骨膜缺損，隨機平均分成4組(一個實驗組和三個對照組，每組各9側)，實驗組在缺損處填塞由骨髓基質(zhì)干細胞(BMSCs)和具有特殊外型(側槽和中空管)的β-磷酸三鈣(β-TCP)支架體外構建的復合物，在中空管內(nèi)移入隱動、靜脈束的一段，外被帶蒂深筋膜；其余3個對照組分別填塞組織工程骨并包裹筋膜、單純組織工程骨和單純支架組。另外2只獼猴的無填充物脛骨缺損作空白對照

5、。鋼板螺釘固定。在4、8、12周時間點分別行放射影像學評分和X射線阻射密度分析，以及血管面積和成骨圖像分析。得出數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。 結果： 第一部分：獼猴BMSCs體外增殖能力較強，在傳3代后的第6天達高峰。細胞經(jīng)誘導后，在第3天就可見良好的定向分化能力。該支架材料與獼猴BMSCs具有良好的相容性。但材料在加入培養(yǎng)基后會出現(xiàn)崩解，對細胞的初期附著有一定影響。 第二部分：本實驗以通過對組織工程骨材料外型的特殊設計

6、，采用血管植入和筋膜包裹的血管化方法修復獼猴雙側脛骨20mm缺損為實驗模型，進行了術后大體觀察、X線和組織學檢測，初步完成了模型的設計和檢測工作，認為模型是可行的，為進一步的臨床試驗提供了參考，但需要更深入的研究。 第三部分： 一般觀察術后4周：4組標本無明顯差異，均在兩接觸面、材料后面和鋼板側有部分結締組織或軟骨樣組織形成，中空管及側槽為軟組織填塞，材料與骨接觸面能折動。A組材料中空管內(nèi)原植入血管腔內(nèi)充滿墨汁。材料本身

7、無明顯吸收。 術后8周：4組標本觀察有差異。A組植入物除前面外，其余各面及與骨接觸面均有骨樣組織包裹，側槽及中空管也有骨樣組織填塞，植入血管觀察不清，不易折斷，材料1/3吸收；B組在植入物內(nèi)側面、前面及中空管內(nèi)無骨樣組織形成，其余各面及與骨接觸面僅有少部分骨樣組織形成，易折斷，材料無明顯吸收。C和D組植入物與骨接觸面僅有少部分骨樣組織形成，易折斷，材料無明顯吸收。4組標本均有墨染，以A，B兩組最明顯。術后12周：4組標本觀察有明

8、顯差異。A組植入物各面及中央部完全被骨樣組織所包裹或替代，堅硬，折不斷，材料2/3被吸收；B組和C組植入物于內(nèi)側及前面仍有部分材料未被骨樣組織所包裹或替代，用力可以折斷，材料1/3被吸收。D組成骨罕見，材料無吸收，輕易彎折。 空白組(12 w)缺損處完全被肉芽組織填塞，無骨樣組織增生。 顯微鏡下觀察A組術后4周時在移植物邊緣、斷面及中央有少量新生骨組織——編織骨形成，臨近新骨處的材料孔隙內(nèi)也有新骨的形成和小“肺泡樣”墨染

9、結構，植入血管腔內(nèi)墨染，材料較完整，孔隙未見擴大。8周時新骨形成明顯增多，墨染血管樣結構明顯增多，多靠近外緣及中央，于新骨與材料交接處可見破碎的材料，小顆粒狀，植入血管腔內(nèi)未見墨染。12周時移植物完全被骨樣組織所包裹，形成的骨樣組織把材料分成幾小塊，有骨小梁樣結構形成。于新骨及剩下的材料中均能見到血管樣結構，密度明顯增大。新骨中的血管樣結構較粗大，走行直，少有分支；材料中的血管樣結構多呈“肺泡狀”，分支多，串珠樣，孔隙之間有交通。于新骨

10、與材料交接處可見較多破碎的材料，小顆粒狀，此處的墨染血管樣結構最多。 B組術后4周時在移植物邊緣、斷面有少量新生骨組織——編織骨形成，材料孔隙內(nèi)也有新骨的形成和小“肺泡樣”墨染結構，植入血管腔內(nèi)墨染，材料較完整，孔隙未見擴大。8周時新骨形成增多，墨染血管樣結構明顯增多，多靠近外緣，于新骨與材料交接處可見破碎的材料，植入血管腔內(nèi)未見墨染。12周時形成的骨樣組織把材料大部分包被，有骨小梁樣結構形成。于材料中央部少見血管樣結構。

11、 C組術后4周時在移植物邊緣和中央未見新生骨組織，僅在斷面處有少量編織骨形成，移植物僅有一面(后面)外緣有小“肺泡樣”墨染結構，移植物完整，孔隙未見增大。8周時在移植物邊緣、斷面有少量新生骨組織形成，僅在新骨與材料交接處可見較多墨染血管樣結構，余處少見。12周時可見移植物有少部分吸收，新骨及血管樣結構的形成量比同組8周的有所增加，但仍然很稀少。 D組4周時無成骨，移植物斷端處可見有少量墨染結構。8周時僅在斷端可見少量成骨，墨染

12、結構較4周時增加。12周時移植物斷端的成骨情況并未增加，墨染結構也未增加。 血管面積及成骨面積分析各時間點上A組中央部和周圍部的血管樣結構面積及成骨面積與B、C和D組比較有顯著差異(P<0.01)。而且隨時間的推移呈上升趨勢。B和C組中央部血管樣結構面積比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。B組周圍部的血管樣結構面積與C組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 放射線觀察A組8周顯示移植物密度降低，兩斷面有連續(xù)性骨痂形成；12周

13、顯示移植物密度明顯降低，個別區(qū)域低于正常骨，連續(xù)性骨痂明顯。B和C組8周和12周移植物密度未見降低，斷面處有連續(xù)性骨痂。D組各時間點無明顯變化。 影像評分從正位X線片骨缺損部位阻射密度值中可以看出，4 w各組間無差異，B和C組各時間點間無差異；8、12 w A組與B和C間有差異，A組各時間點間有顯著差異(P<0.01)。A組各時間點阻射密度值呈減少趨勢，可能和材料被逐漸吸收有關。 結論： 本實驗以通過對組織工程骨