成年恒河猴體內(nèi)異位構(gòu)建血管化組織工程骨的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的 (1)對(duì)猴骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(rBMSc)進(jìn)行體外培養(yǎng)及擴(kuò)增，觀察其原代及傳代細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)及生物學(xué)特點(diǎn)。 (2)觀察恒河猴骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(rBMSc)與新型可吸收羥基磷灰石(HA)及AO人工骨β-磷酸三鈣(β-TCP)的體外相容性。為在靈長(zhǎng)類動(dòng)物體內(nèi)構(gòu)建組織工程化骨作材料方面的準(zhǔn)備。 (3)用血管束植入法異位構(gòu)建血管化的組織工程骨，觀察血管化的效果及對(duì)成骨作用的影響。 (4)用綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)

2、記rBMSc，觀察其在組織工程骨體內(nèi)構(gòu)建中對(duì)種子細(xì)胞的示蹤作用。 (5)對(duì)恒河猴體內(nèi)構(gòu)建組織工程骨進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)。 方法 (1)從髂后上棘抽取成年恒河猴骨髓，用全骨髓培養(yǎng)法進(jìn)行體外培養(yǎng)獲得BMSc，胰酶消化傳代，用條件培養(yǎng)基培養(yǎng)傳代細(xì)胞。逐日倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，對(duì)傳代細(xì)胞進(jìn)行HE染色及堿性磷酸酶(ALP)染色。 (2)取第三代恒河猴骨髓基質(zhì)細(xì)胞與材料復(fù)合培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分三組：A組將rBMSc與HA復(fù)合

3、培養(yǎng)，B組rBMSc與β-TCP復(fù)合培養(yǎng)，C組為對(duì)照，只有細(xì)胞不加材料。倒置相差顯微鏡、掃描電鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)及增殖情況，MTT法半定量檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。 (3)將可降解HA訂制成中空的圓柱體，側(cè)方開槽。實(shí)驗(yàn)分4組，①可吸收羥基磷灰石(HA)組(M組)：?jiǎn)螌⒉牧现灿诩〈鼉?nèi)；②HA+rBMSc組(MC)：將材料接種誘導(dǎo)培養(yǎng)的rBMSc；③HA+血管束植入組(MB)：將材料內(nèi)植入血管束，不加細(xì)胞；④HA+血管束植入+rBMSc(M

4、BC)：材料接種細(xì)胞并植入血管束。需種細(xì)胞的組別，將經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)的rBMSc以5×106/ml的密度接種于材料上。血管束植入組，將胸背動(dòng)靜脈分離，將其游離約4～5cm，將血管束從材料的側(cè)槽內(nèi)放進(jìn)材料，埋置于背闊肌內(nèi)。術(shù)后選取不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行①一般觀察：觀察術(shù)后精神、進(jìn)食及活動(dòng)情況，傷口愈合情況。②X線觀察：術(shù)后4、8、12周照片。測(cè)取每組材料區(qū)的透光度，進(jìn)行多樣本均數(shù)的方差分析。③ECT檢測(cè)：術(shù)后6周、18周，將實(shí)驗(yàn)猴麻醉后，經(jīng)小腿淺靜脈“

5、彈丸式”注射锝亞甲基二瞵酸鹽(10mCi)，3小時(shí)后以1幀/5分采集靜態(tài)顯相，即延遲相(骨相)，測(cè)取感興趣區(qū)(ROI)的計(jì)數(shù)率(CPS)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組測(cè)4次，求每組均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，進(jìn)行方差分析。④組織學(xué)檢查：術(shù)后4、8、12周取材，脫鈣制作切片，HE染色，光鏡下觀察。 (4)用QBI-293A細(xì)胞對(duì)腺病毒Ad5.CMV-GFP進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)定病毒滴度。以一定滴度的Ad5.CMV-GFP轉(zhuǎn)染rBMSc，將轉(zhuǎn)染成功的第三代BMSc在轉(zhuǎn)

6、染后48h消化制成細(xì)胞懸液，接種至塊狀可吸收HA上，體外培養(yǎng)3天后，將其植入恒河猴(同體移植)背闊肌的肌袋內(nèi)，以未轉(zhuǎn)染GFP的BMSc用同樣的方法接種塊狀可吸收HA上，作為對(duì)照。術(shù)后6周取材，4％的中性多聚甲醛固定，塑料包埋，制作骨磨片。另行PI染色在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀測(cè)。 (5)對(duì)恒河猴體內(nèi)構(gòu)建組織工程骨進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)，檢測(cè)①長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)：分別于術(shù)前、2、4、12周四個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)量體重，觀察植入后動(dòng)物的生理狀況；血常規(guī)骨髓

7、相；血生化指標(biāo)②植入試驗(yàn)：術(shù)后2、4、12周分別取植入物周圍肌肉組織，石蠟包埋切片，HE染色，觀察炎性浸潤(rùn)情況、纖維包囊形成及有無異形細(xì)胞。③遺傳毒性試驗(yàn)：植入前及組織工程構(gòu)建物植入后2、4、12周，作骨髓涂片，觀察骨髓嗜多染紅細(xì)胞內(nèi)的微核形成。 結(jié)果 (1)成年雄性恒河猴BMSc體外培養(yǎng)生長(zhǎng)良好，原代細(xì)胞9～13天匯成單層，傳代后4～7天長(zhǎng)滿瓶底。HE染色光鏡下觀察見BMSc分裂相多見，細(xì)胞呈梭形、多角形，傳代細(xì)胞堿性

8、磷酸酶染色呈強(qiáng)陽性。 (2)倒置顯微鏡下見HA組細(xì)胞生長(zhǎng)良好，與對(duì)照組無顯著差異。β-TCP組有一些細(xì)小顆粒脫落散在分布于板底或細(xì)胞表面，有少量細(xì)胞脫落死亡。掃描電鏡見HA組細(xì)胞貼附、增殖良好，β-TCP組細(xì)胞貼附率不高。MTT法顯示HA組細(xì)胞增殖與對(duì)照組接近，而β-TCP組增殖較低，與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 (3)術(shù)后12只恒河猴精神、進(jìn)食均正常，傷口無紅腫及滲出，術(shù)后4～5天即完全愈合。取材時(shí)發(fā)現(xiàn)各組各時(shí)間點(diǎn)材料降

9、解不很明顯，材料表面可見有薄層纖維包囊，血管束和材料已長(zhǎng)成一體，材料的管道內(nèi)已長(zhǎng)滿了軟組織。MBC組可見材料內(nèi)有不規(guī)則成骨。其余組大體所見成骨不明顯。植入4周時(shí)，與M組比較，MC、MB及MBC組的透光度略有降低，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。8周時(shí)，M組透光度較前降低不明顯，MC、MB及MBC組透光度有所降低，MBC、MC組與M組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。MB組與M組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。12周時(shí)，透光度降低幅度從大

10、到小依次是MBC、MC、MB組，M較前略有降低。方差分析表明，較之M組，各組均顯著意義，其中MC、MB組P＜0.05,MBC組P＜0.01。術(shù)后6周，ECT延遲相(骨相)顯示加入血管束的兩組(MB及MBC)放射性核素濃集度高，而MBC組又要高于MB組，兩組較之M組差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；沒有加血管束的兩組M及MC組核素濃度明顯偏低，而MC組又較M組濃度高，但差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。術(shù)后18周，核素濃度從高到低依次為

11、MBC組、MC組、MB組和M組，以M組為對(duì)對(duì)照，各組與之差別均有統(tǒng)計(jì)意義(P＜0.01)。組織學(xué)檢查：術(shù)后4周，M組未見成骨，大量纖維組織長(zhǎng)入多孔狀的材料內(nèi)，MB、MC、MBC組各有少量成骨，成骨見于材料孔隙邊緣。8周時(shí)，M組仍見纖維組織，未見明顯成骨。MC組見材料空隙邊緣成骨增多，MB也可見少許新骨形成，MBC組可見較多新生骨組織形成。12周，M組可見很少量骨組織形成。MC組部分區(qū)域有較多骨組織形成，MB組成骨增加不明顯，MBC組則可

12、見較為成熟的骨組織形成。 (4)轉(zhuǎn)染GFP后，rBMSc仍貼壁生長(zhǎng)，呈梭形或多角形，仍分裂增殖，但增殖速度有所降低。熒光顯微鏡下，24h可見有綠色熒光表達(dá)，但數(shù)量較少，強(qiáng)度較低，48h可見細(xì)胞發(fā)出強(qiáng)烈的熒光，呈全細(xì)胞分布，計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)染率達(dá)80％。將體內(nèi)構(gòu)建6周的組織工程骨取材做成磨片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察，可以見材料內(nèi)有發(fā)出較綠色強(qiáng)熒光的細(xì)胞樣結(jié)構(gòu)。PI染色后發(fā)出綠色熒光的結(jié)構(gòu)同時(shí)也被PI染色，表明為細(xì)胞結(jié)構(gòu)，測(cè)量其直徑為20μ

13、m左右，與rBMSc的大小相符。 (5)長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)：整個(gè)受試期無一動(dòng)物死亡，體重逐漸增加。精神、行為、活動(dòng)、攝食及糞便無異常，無血尿。術(shù)后體重逐漸增加。術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)和術(shù)前相比，外周血象、血生化均無明顯差異(P＞0.05)，各時(shí)間點(diǎn)骨髓相均增生活躍，各系、各階段細(xì)胞比例、形態(tài)正常。植入試驗(yàn)：各組肌肉未見明顯充血、變性及壞死。2周在界面周圍的肌肉內(nèi)可見到少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以淋巴細(xì)胞為主。細(xì)胞-材料復(fù)合物周圍見不同程度的纖維細(xì)胞增生

14、及纖維組織形成。4周浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞基本消失，增生的纖維組織逐漸形成比較完整的包膜。8周、12周纖維包膜變薄，完整地包繞組織工程骨。浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞消失。未見到異物巨細(xì)胞的出現(xiàn)。微核試驗(yàn)：各組在鏡下少有嗜多染紅細(xì)胞，均未發(fā)現(xiàn)微核形成。 結(jié)論 (1)恒河猴BMSc的體外培養(yǎng)增殖能力強(qiáng)，可誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞，可作為骨組織工程的種子細(xì)胞。 (2)新型HA與rBMSc生物相容性好，可用作恒河猴骨組織工程的支架材料，AO人工骨需要