四川地區(qū)白三葉高效根瘤菌株的初步篩選及系統(tǒng)發(fā)育研究.pdf

1、白三葉(Trifolium repens L.)是豆科三葉草屬多年生優(yōu)良飼草，具有品質(zhì)高，再生性好，刈牧兼用的特點(diǎn)，享有我國南方“當(dāng)家豆科牧草”之美譽(yù)。又因其形態(tài)優(yōu)美，觀賞性好，適應(yīng)性和固氮能力強(qiáng)，在水土保持、環(huán)境綠化以及生態(tài)建設(shè)方面應(yīng)用越來越廣泛。面臨環(huán)境惡化的嚴(yán)峻壓力，篩選并接種豆科植物高效根瘤菌不僅可提供氮素營養(yǎng)，提高產(chǎn)量和質(zhì)量，而且對(duì)減少化肥使用量，降低環(huán)境污染，具有良好的經(jīng)濟(jì)效益、社會(huì)效益和生態(tài)效益。
　　本研究從四川雅

2、安、康定、西昌等地采集到的80余份白三葉根瘤樣品中分離與純化得到供試菌株，通過水培和砂培試驗(yàn)初步篩選出與白三葉共生匹配的高效根瘤菌菌株，同時(shí)采用16S rDNA PCR-RFLP選取代表菌株，對(duì)菌株16S rDNA、持家基因(recA、atpD、glnⅡ)及共生基因(nodC和nifH)的序列測(cè)定分析進(jìn)行遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育研究，以進(jìn)一步確定所選高效菌株的分類地位，主要結(jié)果如下:
　　1.不同采集地白三葉的根瘤呈現(xiàn)有橢圓形、球形、

3、圓錐狀和葫蘆狀等多種形態(tài)，外觀為粉紅色。從根瘤中所分離的根瘤菌菌株，在含剛果紅的YMA平板上的菌落均為圓形，不吸色而呈乳白色，粘稠狀，透明或半透明，邊緣整齊，表面稍凸起而富有光澤，革蘭氏染色為陰性，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中均不生長（LS1105除外），符合根瘤菌典型的個(gè)體形態(tài)和菌落特征，采用平板劃線分離法共分離獲得72株菌株。
　　2.水培試驗(yàn)結(jié)果表明，除了LS1105、XC1102、XC1103、XC1112、KD1109共5株菌

4、株外，其余67株供試菌株接種的白三葉植株全部結(jié)瘤，且結(jié)瘤數(shù)、株高、植株鮮重和干重顯著高于CK和未結(jié)瘤的植株。其中，以KD1104、KD1111、KD1117、LD1102、YA1105、YA1103、YA1121、XC1108、XC1109、XC1110、CD1105、LS1104共12株菌株接種效果最為明顯，植株生長高大健壯，充滿活力，具有很強(qiáng)篩選出高效菌株的潛力，可用于進(jìn)一步的砂培試驗(yàn)。
　　3.以上12株菌株的砂培試驗(yàn)結(jié)果表

5、明，與未接種的相比，接種根瘤菌菌株的白三葉植株高大，長勢(shì)茂盛，葉片寬大且濃綠，所有供試菌株都全部結(jié)瘤。其中，接種菌株YA1121和CD1105，顯著提高了植株的結(jié)瘤數(shù)、株高、鮮重、干重、葉綠素含量和全氮含量，比未接種的分別增加了90.89％、103.09％、187.98％、51.27％、40.92％和68.23％、86.32％、114.38％、54.70％、33.22％，為初步篩選出的白三葉根瘤菌高效菌株。
　　4.16S rDN

6、A PCR-RFLP分析中所有供試菌株產(chǎn)生了4種酶切圖譜類型，表現(xiàn)出較為豐富的遺傳多樣性。其中,有類型Ⅰ(AAAA)69株菌，占據(jù)供試菌株的95.8％，其余Ⅱ(BBBB)、Ⅲ(CACA)、Ⅳ(DCDC)三種類型各有1株菌，分別為LS1101、LS1105和KD1107，僅占4.2％，表現(xiàn)出了一定的遺傳變異和地域差異。16S rDNA序列測(cè)定分析結(jié)果表明，全部供試菌株分別歸屬于根瘤菌屬（Rhizobium）和土壤桿菌屬（Agrobacte

7、rium）2個(gè)系統(tǒng)分支。除了LS1105與Ag.tumefaciens NCPPB2437T的親緣關(guān)系最近，相似性達(dá)到99.5％外，絕大部分菌株與R leguminosarum bv.trifolii ATCC14480T序列相似性在99.7％以上。
　　5.持家基因(recA、atpD、glnⅡ)的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果與16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果基本一致，供試菌株也歸屬于根瘤菌屬和土壤桿菌屬2個(gè)系統(tǒng)分支。LS1105亦與Ag.

8、tumefaciens NCPPB2437T聚在一起，它們之間的相似性為92.4％，其余菌株與R.leguminosarum bv.trifolii ATCC14480T的序列關(guān)系最近，相似性在93.4％～95.0％之間。從屬于根瘤菌屬的菌株可用PCR擴(kuò)增出nodC和nifH共生基因片段，但從屬于土壤桿菌屬的菌株LS1105中則擴(kuò)增不出這兩個(gè)基因。從兩者構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹來看，除了LS1105以外，其余的菌株均以R.leguminosar

9、um bv.trifolii ATCC14480T和R.leguminosarum bv.trifolii9.2k(R2-1)的相似性為95.6％～97.5％之間，可以確定其為白三葉根瘤菌。
　　綜合菌株篩選和系統(tǒng)發(fā)育研究的結(jié)果，菌株YA1121和CD1105為初步篩選出的高效白三葉根瘤菌，可應(yīng)用于后續(xù)的田間試驗(yàn)作更進(jìn)一步的研究。并通過不同采樣地點(diǎn)菌株之間的比較，發(fā)現(xiàn)白三葉與根瘤菌的共生關(guān)系因地理分布不同而具有多樣性，對(duì)于豐富白三