甘草提取物及其三種主要成分對Caco-2細(xì)胞膜上P-gp功能和表達(dá)的影響.pdf

1、一、目的：
　　 通過考察甘草提取物及其三種主要成分(甘草甜素、甘草次酸和甘草苷)對Caco-2細(xì)胞膜上P-gp功能和表達(dá)的影響,篩選其有效成分以備進(jìn)一步探討甘草新的解毒機(jī)制。
　　 二、方法：
　　 1細(xì)胞培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)驗(yàn)證
　　 為甘草提取物及其三種主要成分(甘草甜素、甘草次酸和甘草苷)對P-糖蛋白(P-gp)功能和表達(dá)的作用研究提供P-gp載體細(xì)胞和陰性對照細(xì)胞。
　　 人結(jié)腸癌細(xì)胞(Caco

2、-2)和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(ECV304)分別采用MEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)；細(xì)胞免疫熒光法進(jìn)行細(xì)胞膜上P-gp表達(dá)驗(yàn)證。
　　 2細(xì)胞毒性試驗(yàn)
　　 用MTT法分別考察甘草提取物及其三種主要成分(甘草甜素、甘草次酸和甘草苷)、利福平與維拉帕米對Caco-2細(xì)胞及ECV304細(xì)胞的毒性,選擇細(xì)胞存活率大于90％的藥物濃度作為無毒濃度進(jìn)行下一步細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。
　　 3甘草提取物及其三種主要成分(甘草甜素、甘草

3、次酸和甘草苷)對P-糖蛋白功能的影響
　　 用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞內(nèi)羅丹明123的熒光強(qiáng)度,考察甘草提取物及其三種主要成分(甘草甜素、甘草次酸和甘草苷)對P-糖蛋白介導(dǎo)的羅丹明123外排作用的影響,從而判斷藥物對P-糖蛋白的功能有何影響。
　　 4甘草提取物及其三種主要成分(甘草甜素、甘草次酸和甘草苷)對P-糖蛋白表達(dá)的影響
　　 將甘草提取物及其三種主要成分(甘草甜素、甘草次酸和甘草苷)與細(xì)胞作用72小時(shí)后,采用

4、流式細(xì)胞術(shù)分析甘草提取物及其三種主要成分(甘草甜素、甘草次酸和甘草苷)對Caco-2細(xì)胞膜上P-糖蛋白表達(dá)的影響。
　　 三、結(jié)果：
　　 1細(xì)胞培養(yǎng)
　　 Caco-2細(xì)胞和ECV304細(xì)胞在正常條件下生長旺盛,Caco-2細(xì)胞高表達(dá)P-糖蛋白,適合研究甘草提取物及其三種主要成分(甘草甜素、甘草次酸和甘草苷)對P-糖蛋白功能和表達(dá)的影響；而陰性對照細(xì)胞ECV304細(xì)胞低表達(dá)P-糖蛋白,適合作陰性對照。
　

5、　 2細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
　　 MTT結(jié)果顯示甘草提取物、甘草酸、甘草苷、利福平和維拉帕米的濃度為0.01～100μg·mL-1,甘草次酸的濃度為0.01～10μg·mL-1時(shí)與Caco-2和ECV細(xì)胞培養(yǎng)72h后細(xì)胞的存活率>90％,為非細(xì)胞毒性濃度,故選取甘草提取物、甘草酸和甘草苷的低、中、高濃度為1、10、100μg·mL-1,甘草次酸的低、中、高濃度為0.1、1、10μg·mL-1,陽性對照藥品利福平和維拉帕米的濃度為10μ

6、g·mL-1進(jìn)行下一步的研究。
　　 3甘草提取物及其三種主要成分(甘草甜素、甘草次酸和甘草苷)對P-糖蛋白功能的影響
　　 100～1μg·mL-1的甘草提取物、甘草酸和甘草苷對P-糖蛋白介導(dǎo)的羅丹明123外排有顯著的增強(qiáng)作用(P<0.05)。甘草提取物、甘草酸和甘草苷三種物質(zhì)的低、中、高濃度組Caco-2細(xì)胞內(nèi)Rho-123的熒光強(qiáng)度較陰性對照組顯著降低了34.66％、28.90％、24.56％、27.89％、26.

7、29％、37.33％、19.51％、21.86％和19.03％。
　　 4甘草提取物及其三種主要成分(甘草甜素、甘草次酸和甘草苷)對P-糖蛋白表達(dá)的影響
　　 甘草提取物中濃度組,甘草甜素低、中、高濃度組,甘草次酸中、高濃度組Caco-2細(xì)胞膜上P-gp的陽性率較陰性組分別顯著增加了31.18％、61.67％、70.32％、77.43％、37.58％和49.14％(P<0.05),顯示甘草提取物、甘草甜素和甘草次酸在一定

8、濃度范圍內(nèi)能夠顯著上調(diào)P-gp的表達(dá)水平,甘草酸和甘草次酸的作用在該濃度范圍呈濃度依賴性。甘草苷在較低濃度時(shí)能顯著抑制P-gp的表達(dá),甘草苷低濃度組P-gp的陽性率相比陰性組顯著降低37.17％(P<0.05)。
　　 四、結(jié)論：
　　 甘草提取物及其三種主要成分(甘草甜素、甘草次酸和甘草苷)能夠影響Caco-2細(xì)胞膜上P-gp的功能和表達(dá)。甘草酸單胺鹽的瞬時(shí)作用(60min)能濃度依耐性的誘導(dǎo)P-糖蛋白的功能,長時(shí)作用