低蛋氨酸對Caco-2腸上皮細胞緊密連接蛋白表達和功能的影響.pdf

1、炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）是一組慢性非特異性腸道炎癥性疾病，常見為克羅恩病(CD)與潰瘍性結腸炎(UC)，部分為炎癥性腸病未定型(IBDU)。IBD病因及發(fā)病機制尚未明確，可能與遺傳、環(huán)境、微生物感染以及免疫反應等多種因素有關。近年來，腸黏膜屏障功能在IBD發(fā)生發(fā)展中的作用受到了廣泛研究。腸黏膜屏障功能受損既是IBD疾病的表現(xiàn)，又是IBD潛在的致病因素，同時增加IBD復發(fā)的風險。所以，維持

2、和恢復腸黏膜屏障功能將有利于提高腸黏膜的防御功能，促進腸黏膜修復有助于維持緩解、減少IBD復發(fā)。研究表明，限制蛋氨酸含量能夠增強上皮細胞屏障功能。低蛋氨酸處理的LLC-PK1上皮細胞和給予低蛋氨酸飲食的SD大鼠細胞旁路通透性降低，細胞以及大鼠屏障功能增加，緊密連接蛋白的組成和表達發(fā)生變化。另外，項目組前期動物實驗發(fā)現(xiàn)，低蛋氨酸飲食顯著降低正常大鼠腸道通透性，并能減輕IBD大鼠腸黏膜炎癥損傷，通過改變緊密連接蛋白的表達和功能而增強正常大鼠

3、和IBD大鼠的腸黏膜屏障功能，促進腸黏膜損傷的修復。然而，低蛋氨酸對于受損腸屏障的保護機制并不清楚。由此，我們進一步通過Caco-2腸上皮細胞模型對上述結論進行驗證，并檢測相關信號通路，初步探索其可能的機制。
　　目的:在動物實驗的基礎上，進一步研究低蛋氨酸對Caco-2腸上皮細胞及其緊密連接損傷體外模型的影響，并分別檢測MLCK-P-MLC以及Rho/ROCK信號通路，初步探索在炎癥狀態(tài)下，低蛋氨酸對緊密連接蛋白表達和功能影響的

4、可能的調控機制。
　　方法:建立Caco-2腸上皮細胞模型，并通過形態(tài)學觀察、單層細胞完整性及旁路通透性檢測、細胞極性研究四個方面聯(lián)合評價Caco-2模型的可靠性和有效性。根據(jù)是否使用低蛋氨酸培養(yǎng)基以及是否經(jīng)過TNF-α處理48h，將Caco-2細胞分為四組:AA組（對照組）、MR組（低蛋氨酸培養(yǎng)組）、AA+TNF組（正常培養(yǎng)條件下TNF-α處理48h組）、MR+TNF組（低蛋氨酸培養(yǎng)條件下TNF-α處理48h組）。分別檢測各組細

5、胞的跨上皮細胞電阻（transepithelial electrical resistance，TEER）、熒光黃(luciferyellow, LY)透過率和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）活性;應用透射電鏡觀察Caco-2單層細胞緊密連接以及微絨毛結構的改變;通過qPCR、Western blot以及免疫熒光等方法，定位、定量檢測緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1;Western

6、 blot實驗分別檢測MLCK-P-MLC信號通路、Rho/ROCK信號通路各相關蛋白的相對表達量，從蛋白水平分析炎癥狀態(tài)下低蛋氨酸對緊密連接蛋白表達和功能影響的可能的調控機制。
　　結果:
　　(1)Caco-2腸上皮細胞體外模型建立成功，具有很好的重復性和可靠性。
　　(2)加入TNF-α培養(yǎng)48h之后，Caco-2腸上皮細胞TEER值顯著降低（P＜0.01），熒光黃透過率顯著增高（P＜0.01）;MR組與AA組相

7、比，TEER值顯著升高（P＜0.01），細胞極性顯著增加(P＜0.05)，但熒光黃透過率沒有發(fā)生顯著改變;MR+TNF組與AA+TNF組相比，TEER值顯著增加且熒光黃透過率顯著降低(P＜0.05)。
　　(3)透射電鏡的結果表明，不論正常培養(yǎng)還是低蛋氨酸處理的Caco-2腸上皮細胞，緊密連接結構均位于細胞膜外側頂端，呈致密帶狀結構，微絨毛排列緊密、整齊;TNF-α誘導損傷后，腸上皮細胞緊密連接結構破壞、斷裂，微絨毛脫落、稀疏、排

8、列紊亂，可見局部微絨毛消失;低蛋氨酸能夠減輕TNF-α誘導的緊密連接損傷，減少微絨毛的脫落。
　　(4)qPCR和Western blot的結果表明，各組細胞緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1的mRNA和蛋白相對表達量沒有顯著性差異。
　　(5)免疫熒光結果顯示，AA組和MR組Claudin-1、Occludin和ZO-1蛋白沿細胞膜分布，呈蜂巢狀線性熒光，TNF-α能誘導緊密連接蛋白異常分布，可見不

9、連續(xù)的線性熒光染色，細胞間出現(xiàn)間隙，環(huán)斷裂，甚至崩解，但MR+TNF組緊密連接的結構和分布變化較AA+TNF組明顯好轉。
　　(6)Western blot實驗對MLCK-P-MLC信號通路的檢測結果顯示，細胞經(jīng)TNF-α刺激后，MLCK與pMLC蛋白水平顯著增加(P＜0.05)，說明MLCK-P-MLC信號通路被激活;MR+TNF組與AA+TNF組相比，pMLC以及MLCK蛋白表達量顯著降低(P＜0.05)，即低蛋氨酸環(huán)境能夠減

10、弱TNF-α對MLCK-P-MLC信號通路的激活作用。
　　(7)Western blot實驗對Rho/ROCK信號通路的檢測結果顯示，細胞經(jīng)TNF-α刺激后，p-MYPT1、ROCK1以及ROCK2蛋白水平顯著增加(P＜0.05)，說明Rho/ROCK信號通路被激活;MR+TNF組與AA+TNF組相比，p-MYPT1、ROCK1以及ROCK2蛋白相對表達量沒有顯著性差異。
　　結論:
　　(1)Caco-2腸上皮細胞

11、體外模型建立成功，通過聯(lián)合評價的方法從形態(tài)學觀察、TEER值測定、熒光黃透過率測量以及堿性磷酸酶活力測定四個方面來綜合評價Caco-2細胞模型的建立，本模型具有很好的重復性和可靠性。
　　(2) TNF-α能夠改變緊密連接蛋白的結構和空間分布，使得細胞旁路通透性增加，腸上皮細胞屏障功能受損。
　　(3)低蛋氨酸能夠增強腸上皮屏障功能，并且能夠改善TNF-α誘導的腸上皮細胞屏障損傷，這種保護作用可能主要是通過改變緊密連接蛋白的