低蛋氨酸對(duì)Caco-2腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)和功能的影響.pdf

1、炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）是一組慢性非特異性腸道炎癥性疾病，常見為克羅恩病(CD)與潰瘍性結(jié)腸炎(UC)，部分為炎癥性腸病未定型(IBDU)。IBD病因及發(fā)病機(jī)制尚未明確，可能與遺傳、環(huán)境、微生物感染以及免疫反應(yīng)等多種因素有關(guān)。近年來，腸黏膜屏障功能在IBD發(fā)生發(fā)展中的作用受到了廣泛研究。腸黏膜屏障功能受損既是IBD疾病的表現(xiàn)，又是IBD潛在的致病因素，同時(shí)增加IBD復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。所以，維持

2、和恢復(fù)腸黏膜屏障功能將有利于提高腸黏膜的防御功能，促進(jìn)腸黏膜修復(fù)有助于維持緩解、減少IBD復(fù)發(fā)。研究表明，限制蛋氨酸含量能夠增強(qiáng)上皮細(xì)胞屏障功能。低蛋氨酸處理的LLC-PK1上皮細(xì)胞和給予低蛋氨酸飲食的SD大鼠細(xì)胞旁路通透性降低，細(xì)胞以及大鼠屏障功能增加，緊密連接蛋白的組成和表達(dá)發(fā)生變化。另外，項(xiàng)目組前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低蛋氨酸飲食顯著降低正常大鼠腸道通透性，并能減輕IBD大鼠腸黏膜炎癥損傷，通過改變緊密連接蛋白的表達(dá)和功能而增強(qiáng)正常大鼠

3、和IBD大鼠的腸黏膜屏障功能，促進(jìn)腸黏膜損傷的修復(fù)。然而，低蛋氨酸對(duì)于受損腸屏障的保護(hù)機(jī)制并不清楚。由此，我們進(jìn)一步通過Caco-2腸上皮細(xì)胞模型對(duì)上述結(jié)論進(jìn)行驗(yàn)證，并檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路，初步探索其可能的機(jī)制。
　　目的:在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究低蛋氨酸對(duì)Caco-2腸上皮細(xì)胞及其緊密連接損傷體外模型的影響，并分別檢測(cè)MLCK-P-MLC以及Rho/ROCK信號(hào)通路，初步探索在炎癥狀態(tài)下，低蛋氨酸對(duì)緊密連接蛋白表達(dá)和功能影響的

4、可能的調(diào)控機(jī)制。
　　方法:建立Caco-2腸上皮細(xì)胞模型，并通過形態(tài)學(xué)觀察、單層細(xì)胞完整性及旁路通透性檢測(cè)、細(xì)胞極性研究四個(gè)方面聯(lián)合評(píng)價(jià)Caco-2模型的可靠性和有效性。根據(jù)是否使用低蛋氨酸培養(yǎng)基以及是否經(jīng)過TNF-α處理48h，將Caco-2細(xì)胞分為四組:AA組（對(duì)照組）、MR組（低蛋氨酸培養(yǎng)組）、AA+TNF組（正常培養(yǎng)條件下TNF-α處理48h組）、MR+TNF組（低蛋氨酸培養(yǎng)條件下TNF-α處理48h組）。分別檢測(cè)各組細(xì)

5、胞的跨上皮細(xì)胞電阻（transepithelial electrical resistance，TEER）、熒光黃(luciferyellow, LY)透過率和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）活性;應(yīng)用透射電鏡觀察Caco-2單層細(xì)胞緊密連接以及微絨毛結(jié)構(gòu)的改變;通過qPCR、Western blot以及免疫熒光等方法，定位、定量檢測(cè)緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1;Western

6、 blot實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)MLCK-P-MLC信號(hào)通路、Rho/ROCK信號(hào)通路各相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)量，從蛋白水平分析炎癥狀態(tài)下低蛋氨酸對(duì)緊密連接蛋白表達(dá)和功能影響的可能的調(diào)控機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　(1)Caco-2腸上皮細(xì)胞體外模型建立成功，具有很好的重復(fù)性和可靠性。
　　(2)加入TNF-α培養(yǎng)48h之后，Caco-2腸上皮細(xì)胞TEER值顯著降低（P＜0.01），熒光黃透過率顯著增高（P＜0.01）;MR組與AA組相

7、比，TEER值顯著升高（P＜0.01），細(xì)胞極性顯著增加(P＜0.05)，但熒光黃透過率沒有發(fā)生顯著改變;MR+TNF組與AA+TNF組相比，TEER值顯著增加且熒光黃透過率顯著降低(P＜0.05)。
　　(3)透射電鏡的結(jié)果表明，不論正常培養(yǎng)還是低蛋氨酸處理的Caco-2腸上皮細(xì)胞，緊密連接結(jié)構(gòu)均位于細(xì)胞膜外側(cè)頂端，呈致密帶狀結(jié)構(gòu)，微絨毛排列緊密、整齊;TNF-α誘導(dǎo)損傷后，腸上皮細(xì)胞緊密連接結(jié)構(gòu)破壞、斷裂，微絨毛脫落、稀疏、排

8、列紊亂，可見局部微絨毛消失;低蛋氨酸能夠減輕TNF-α誘導(dǎo)的緊密連接損傷，減少微絨毛的脫落。
　　(4)qPCR和Western blot的結(jié)果表明，各組細(xì)胞緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量沒有顯著性差異。
　　(5)免疫熒光結(jié)果顯示，AA組和MR組Claudin-1、Occludin和ZO-1蛋白沿細(xì)胞膜分布，呈蜂巢狀線性熒光，TNF-α能誘導(dǎo)緊密連接蛋白異常分布，可見不

9、連續(xù)的線性熒光染色，細(xì)胞間出現(xiàn)間隙，環(huán)斷裂，甚至崩解，但MR+TNF組緊密連接的結(jié)構(gòu)和分布變化較AA+TNF組明顯好轉(zhuǎn)。
　　(6)Western blot實(shí)驗(yàn)對(duì)MLCK-P-MLC信號(hào)通路的檢測(cè)結(jié)果顯示，細(xì)胞經(jīng)TNF-α刺激后，MLCK與pMLC蛋白水平顯著增加(P＜0.05)，說明MLCK-P-MLC信號(hào)通路被激活;MR+TNF組與AA+TNF組相比，pMLC以及MLCK蛋白表達(dá)量顯著降低(P＜0.05)，即低蛋氨酸環(huán)境能夠減

10、弱TNF-α對(duì)MLCK-P-MLC信號(hào)通路的激活作用。
　　(7)Western blot實(shí)驗(yàn)對(duì)Rho/ROCK信號(hào)通路的檢測(cè)結(jié)果顯示，細(xì)胞經(jīng)TNF-α刺激后，p-MYPT1、ROCK1以及ROCK2蛋白水平顯著增加(P＜0.05)，說明Rho/ROCK信號(hào)通路被激活;MR+TNF組與AA+TNF組相比，p-MYPT1、ROCK1以及ROCK2蛋白相對(duì)表達(dá)量沒有顯著性差異。
　　結(jié)論:
　　(1)Caco-2腸上皮細(xì)胞

11、體外模型建立成功，通過聯(lián)合評(píng)價(jià)的方法從形態(tài)學(xué)觀察、TEER值測(cè)定、熒光黃透過率測(cè)量以及堿性磷酸酶活力測(cè)定四個(gè)方面來綜合評(píng)價(jià)Caco-2細(xì)胞模型的建立，本模型具有很好的重復(fù)性和可靠性。
　　(2) TNF-α能夠改變緊密連接蛋白的結(jié)構(gòu)和空間分布，使得細(xì)胞旁路通透性增加，腸上皮細(xì)胞屏障功能受損。
　　(3)低蛋氨酸能夠增強(qiáng)腸上皮屏障功能，并且能夠改善TNF-α誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞屏障損傷，這種保護(hù)作用可能主要是通過改變緊密連接蛋白的