西瓜根結(jié)線蟲(chóng)抗性相關(guān)基因同源序列的克隆與分析.pdf

1、西瓜(Citrullus lanatus(Thunb.) Manf.）是一種世界性的園藝作物，在世界十大果品中名列第五，占有十分重要的地位，然而栽培西瓜容易受到各種病原物如根結(jié)線蟲(chóng)、枯萎病、病毒病等的侵染，隨著近年來(lái)溫室西瓜栽培面積的擴(kuò)大及受連作栽培制度的限制，西瓜受根結(jié)線蟲(chóng)的危害愈加嚴(yán)重。由根結(jié)線蟲(chóng)侵染所引起的西瓜根結(jié)線蟲(chóng)病害是一種世界性的西瓜病害，目前防治西瓜根結(jié)線蟲(chóng)病害的主要途徑仍然是運(yùn)用化學(xué)方法，這對(duì)土壤環(huán)境和人類健康有著巨大的

2、潛在威脅，生物防治和物理防治相對(duì)安全，但是見(jiàn)效慢，因此，選育抗根結(jié)線蟲(chóng)的西瓜品種或砧木是安全防治根結(jié)線蟲(chóng)的最根本方法。采用常規(guī)育種方法選育抗病品種存在育種周期長(zhǎng)、效率低等缺點(diǎn)，利用分子技術(shù)輔助育種可以大大縮短育種年限，加快育種進(jìn)程，克隆西瓜抗病基因成為當(dāng)前利用分子技術(shù)輔助育種的工作基礎(chǔ)。
　　本試驗(yàn)采用RGA(Resistance gene analogs)策略，即根據(jù)已經(jīng)克隆植物抗病基因產(chǎn)物的保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)引物，以gDNA和cD

3、NA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到該植物的抗病基因同源序列（Resistance gene analogs，RGA），然后分析RGA與抗病基因的關(guān)系，確定候選基因并最終獲得新的抗病基因。
　　本試驗(yàn)以西瓜抗根結(jié)線蟲(chóng)材料“紅籽瓜”和感根結(jié)線蟲(chóng)材料“ZDPI0006”及二者雜交后代F1為主要研究對(duì)象，利用西瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，一方面根據(jù)已克隆植物抗線蟲(chóng)基因檢索西瓜抗線蟲(chóng)基因同源序列，據(jù)此設(shè)計(jì)引物，另一方面根據(jù)西瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)公布的NBS基因序

4、列設(shè)計(jì)引物，共設(shè)計(jì)了47對(duì)引物，用改良CTAB方法提取西瓜葉片基因組DNA，用試劑盒提取西瓜葉片總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以西瓜gDNA和cDNA為模板，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)差異條帶，最終測(cè)序獲得了12條序列。經(jīng)過(guò)在GenBank上使用Blast搜索和比對(duì)同源序列，結(jié)果表明有1條序列為非特異性擴(kuò)增，共有11個(gè)目標(biāo)片段，分別來(lái)自引物W6580F/W6580R、D3F/D3R、N4F/N4R和N23F/N23R的

5、PCR擴(kuò)增。
　　對(duì)這11條序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明:引物W6580F/W6580R的PCR產(chǎn)物屬于西瓜基因Cla006580，它們之間沒(méi)有長(zhǎng)度多態(tài)性差異，但有3個(gè)SNP位點(diǎn)，其中從感病材料中擴(kuò)增得到的片段W6580-CP1在LRR結(jié)構(gòu)域內(nèi)的一個(gè)不變殘基發(fā)生了氨基酸突變，由L突變?yōu)镕，蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)該片段包含一個(gè)Hs1pro-1_C結(jié)構(gòu)域，與甜菜抗線蟲(chóng)基因蛋白有61％的同源性，該基因?qū)τ谖鞴细Y(jié)線蟲(chóng)抗性基因的定位與克隆具有

6、重要價(jià)值;N4F/N4R的PCR產(chǎn)物屬于西瓜基因Cla012424，該基因可能在野生西瓜種質(zhì)資源中缺失;N23F/N23R屬于西瓜基因Cla006813或者Cla006803，與甜瓜R-FOM-2有82％的同源性;D3F/D3R的PCR產(chǎn)物屬于西瓜基因Cla019854，與預(yù)測(cè)的黃瓜TMV抗性蛋白N端類似結(jié)構(gòu)有高達(dá)88％的同源性。這5條基因?qū)τ谖鞴峡剐曰虻难芯烤哂兄匾獌r(jià)值，可以進(jìn)一步研究，開(kāi)發(fā)與抗病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，從而應(yīng)用于分