腦缺血及再灌注過程中大鼠海馬區(qū)一氧化氮動態(tài)變化的在體研究.pdf

1、缺血性腦損傷是一個復(fù)雜的病理生理過程，其主要病理變化是缺血性神經(jīng)元損傷。以往對缺血性腦損傷的研究認(rèn)為，腦血流中斷后，腦細胞能量供應(yīng)不足而導(dǎo)致腦細胞死亡。近年來研究發(fā)現(xiàn)腦血流中斷和再灌注使腦組織細胞產(chǎn)生損傷級聯(lián)反應(yīng)，至少涉及4個不同的機制：能量障礙和興奮性氨基酸毒性、梗死周圍去極化、炎癥及程序性細胞死亡。大量動物實驗及臨床研究表明，腦缺血及再灌注期間發(fā)生著復(fù)雜的病理生理變化。一方面，腦缺血再灌注既可以挽救瀕臨梗死的細胞，另一方面加重細胞損

2、傷，導(dǎo)致細胞死亡。 而在這個復(fù)雜的過程中，一氧化氮(Nitric Oxide，NO)起著十分重要的作用。其作為一種新型信使分子，同時具有神經(jīng)介質(zhì)和神經(jīng)毒性作用。尤其在腦部的組織中的雙重作用更是近年來研究的重點。一方面它能夠增加皮層供血量，縮小梗死面積；另一方面它能夠與缺血產(chǎn)生的氧自由基協(xié)同造成神經(jīng)細胞損傷。 本論文通過在體檢測腦缺血及再灌注過程中大鼠腦海馬內(nèi)NO的釋放情況，真實反應(yīng)了該過程中NO的釋放變化情況，為進一步研

3、究NO的神經(jīng)介質(zhì)作用和神經(jīng)毒性作用奠定基礎(chǔ)。并以培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)細胞的缺氧缺糖(OGD)為離體腦缺血/再灌注模型(即對培養(yǎng)的海馬神經(jīng)細胞進行缺氧缺糖復(fù)氧復(fù)糖)，利用熒光標(biāo)記和激光共聚焦實時掃描技術(shù)，對海馬神經(jīng)細胞內(nèi)釋放的NO變化進行了檢測，從而完成了對腦缺血/再灌注過程中NO的動態(tài)變化過程的整體與細胞兩個層面的研究。 最新的關(guān)于腦缺血及再灌注損傷的治療方法的研究是通過對再灌注過程的干預(yù)(post-conditioning)來減

4、少腦部梗死面積，但該過程中NO的變化情況、具體的作用機理及究竟哪種干預(yù)方法更有效均未見報道。通過使用本論文中的在體檢測NO方法，實時、連續(xù)地記錄了該干預(yù)過程中NO的變化情況，從而闡明了NO確實參與了缺血后處理，提示NO通路有可能是該方法對腦缺血/再灌注損傷保護作用的一條途徑。同時，利用TTC染色與流式細胞技術(shù)對比了不同后處理方法對于大腦的保護作用，為進一步優(yōu)化該干預(yù)方法提供了一定的理論基礎(chǔ)。 所得結(jié)果如下： 1.海馬內(nèi)N

5、O釋放減少，對血管的舒張作用降低，繼而大鼠血壓上升。這與理論“內(nèi)皮依賴性舒張因子(endothelium-derived relaxing factor，EDRF)和一氧化氮同質(zhì)”相符，進而驗證了該在體檢測NO技術(shù)的真實性和穩(wěn)定性。同時得出結(jié)論，靜脈注射一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)抑制劑L-NAME20μL-30μL后，NO的釋放量減少了4.5 nM-6 nM。 2.大鼠腦缺血/再灌注初期中

6、，海馬內(nèi)NO的變化經(jīng)歷了四個階段：在腦缺血的最初10min，由于大腦供血的迅速減少，NO的釋放量也迅速下降，并達到最低點；之后穩(wěn)定維持在一個低水平；在再灌注初期，由于血液的恢復(fù)，NO釋放量迅速升高，并在10-15 min內(nèi)達到最高點；之后維持在一個穩(wěn)定的高水平。同時通過擬合定標(biāo)曲線，計算得出：在腦缺血過程中海馬內(nèi)NO釋放的減少濃度為0.806±0.221μM，在再灌注初期NO釋放量增加濃度為0.768±0.029μ。 3.在不同

7、的時間點分別靜脈注射內(nèi)皮型NOS(eNOS)/神經(jīng)元型NOS(nNOS)和誘生型NOS(iNOS)的抑制劑，結(jié)果表明在再灌注初期eNOS/nNOS起主要作用，與iNOS沒有關(guān)系，在這個過程中海馬內(nèi)釋放的NO對受損腦組織起到了保護和損傷雙重作用。 4.在離體培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元細胞實驗上，通過共聚焦顯微鏡得到了NO在OGD/復(fù)氧復(fù)糖模型中的變化過程。該過程實驗結(jié)果與在體大鼠實驗結(jié)果相比，NO釋放的變化過程顯得較為簡單.在OGD/復(fù)

8、氧復(fù)糖過程中，NO的表達均有明顯上升，并在再灌注10-12 min后達到穩(wěn)定的平臺期。 5.利用在體檢測NO技術(shù)，實驗發(fā)現(xiàn)缺血后處理(post-conditioning)能夠使大鼠海馬內(nèi)NO的釋放緩慢增加，從而進一步增加腦內(nèi)血流量。我們認(rèn)為，腦缺血后處理所引起的NO緩慢而大量的釋放能夠抑制NO的毒性作用而進一步加大NO對于腦血流的積極增加作用，從而減少腦缺血/再灌注損傷。不同后處理方法對于腦內(nèi)NO釋放的影響不同。 6.對

9、比6組不同的后處理方法(即改變?nèi)毖驮俟嘧⒌臅r間長短及交替的次數(shù))，實驗發(fā)現(xiàn)缺血后處理都可以一定程度上減少腦部梗死面積，提高大鼠海馬內(nèi)神經(jīng)細胞的存活率。但其中3次30s/30s的再灌注/缺血循環(huán)能夠最有效的減少大腦損傷。我們認(rèn)為該方法可能能夠最大程度的激發(fā)腦內(nèi)NO的緩慢大量釋放，說明NO很有可能是post-conditioning改善腦損傷的一條作用途徑。 本論文采用實時、連續(xù)、在體檢測NO結(jié)合熒光標(biāo)記與激光共聚焦實時掃描技術(shù)的

10、方法，分別從整體與細胞兩個層次上對腦缺血/再灌注過程中大鼠海馬內(nèi)NO濃度進行了檢測，全面的闡述了該過程中NO的變化情況以及對腦組織的雙重作用。另一方面，利用NO的在體檢測技術(shù)，首次檢測了在缺血后處理過程中NO的變化情況，揭示了NO可能是該干預(yù)方法作用的一個途徑，并通過對比多種缺血后處理方法對于缺血/再灌注損傷的保護作用，進一步對該干預(yù)方法進行優(yōu)化。 NO在腦缺血/再灌注疾病中發(fā)揮著重要的作用，清楚了解NO在腦缺血/再灌注過程中