腦缺血再灌注過程中神經(jīng)型一氧化氮合酶的SUMO化及其調(diào)控機制的研究.pdf

1、目的：腦缺血再灌注能夠引起細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)SUMO化水平的廣泛上調(diào)，然而，由于SUMO化水平改變而引起的靶蛋白活性的改變、以及他們在神經(jīng)元損傷中的作用機制尚不清楚。神經(jīng)型一氧化氮合酶(nNOS)是腦缺血損傷中一個重要的蛋白分子，本項目研究腦缺血再灌注過程中nNOS的SUMO化及其調(diào)控機制，為發(fā)現(xiàn)缺血性腦損傷中關(guān)鍵信號通路及潛在的藥物治療靶點提供實驗依據(jù)。
　　方法：采用四動脈結(jié)扎法建立SD大鼠全腦缺血.模型，動物分組：假手術(shù)組、缺血再

2、灌注組、給藥組。運用免疫沉淀、免疫印跡對nNOS SUMO化以及nNOS與其它蛋白質(zhì)之間的相互作用進(jìn)行研究。側(cè)腦室或腹腔給藥研究nNOS的SUMO化的調(diào)節(jié)機制。構(gòu)建結(jié)構(gòu)域缺失的nNOS和PIAS3的表達(dá)質(zhì)粒，結(jié)合免疫共沉淀方法鑒定蛋白質(zhì)之間相互結(jié)合的分子基礎(chǔ)。
　　結(jié)果：1.動物分假手術(shù)組(sham)、缺血15min再灌注15min組(I/R)。樣品處理液中有NEM的情況下，免疫印跡顯示，在nNOS條帶上方出現(xiàn)一條條帶，分子量遷移

3、約10-20KD；而無NEM的情況下則無此條帶。應(yīng)用抗SUMO1抗體免疫沉淀，抗nNOS抗體免疫印跡，NEM組出現(xiàn)一條明顯的條帶，而未加入NEM組未發(fā)現(xiàn)有此條帶。2.動物分假手術(shù)組(sham)、缺血15min再灌注不同時間組(I/R)，I/R組較sham而言，nNOS與SUMO1結(jié)合增加。3.與假手術(shù)組相比，缺血再灌注0 min和15 min組PIAS3和nNOS結(jié)合增加，而nNOS與PIAS1、PIAS2、PIAS4的結(jié)合沒有明顯變化

4、。4.腹腔給予右美沙芬(NMDA受體抑制劑)不僅夠抑制缺血再灌注引起的nNOS與SUMO1結(jié)合，而且影響PIAS3與nNOS的結(jié)合。5.側(cè)腦室給予非NMDA受體抑制劑CNQX能夠抑制缺血再灌注引起的nNOS與SUMO1結(jié)合、PIAS3與nNOS結(jié)合的增加。6.側(cè)腦室給予PSD-95反義寡核苷酸，降低PSD-95的表達(dá)，能夠抑制缺血再灌注引起的nNOS與SUMO1、PIAS3與nNOS結(jié)合的增加；7.HEK293T細(xì)胞中共表達(dá)PIAS3、

5、nNOS，缺失了N端(1-320 aa)結(jié)構(gòu)的PIAS3不能與nNOS發(fā)生相互作用，缺失了CaM結(jié)構(gòu)域的nNOS不能與PIAS3發(fā)生相互作用。
　　結(jié)論：1.nNOS是SUMO1的底物2.腦缺血再灌注能夠引起nNOS SUMO化水平的上調(diào)。3.PIAS3為催化nNOS SUMO化的主要SUMO連接酶。4.NMDA受體上調(diào)nNOS SUMO化。5.PSD-95上調(diào)nNOS SUMO化。6.PIAS3的N端(1-320 aa)結(jié)構(gòu)域、