糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、利用雙向凝膠電泳分離視網(wǎng)膜蛋白質(zhì)組中的蛋白點(diǎn)，并運(yùn)用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)成功地鑒定出其中一些蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，通過比較視網(wǎng)膜組織生理和病理狀態(tài)下2-D膠上蛋白質(zhì)“點(diǎn)”的變化，分離表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的“點(diǎn)”進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，可尋找與視網(wǎng)膜疾病相關(guān)的差異蛋白，為研究其發(fā)病機(jī)理、篩選藥物靶標(biāo)以及臨床診斷和治療提供重要的理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 目的： 1．建立并優(yōu)化大鼠視網(wǎng)膜蛋白質(zhì)組分析所需的雙向凝膠電泳 (two-dimensioned

2、electrophoresis，2-DE)技術(shù)，以提高其分辨率及重復(fù)性。 2．觀察8周病程糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)及其蛋白質(zhì)表達(dá)變化情況。 3．比較正常和 8 周病程糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的蛋白質(zhì)表達(dá)差異，運(yùn)用串聯(lián)質(zhì)譜鑒定差異蛋白點(diǎn)并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，初步揭示糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)發(fā)生中可能的分子病理機(jī)制。 方法： 1．用四氧嘧啶(Alloxan)腹腔內(nèi)注射健康雌性

3、 SD 大鼠構(gòu)建糖尿病模型。八周后處死動(dòng)物，立即取出眼球或視網(wǎng)膜用作組織切片、電鏡觀察或蛋白質(zhì)組學(xué)分析。 2．對(duì)正常和糖尿病大鼠視網(wǎng)膜做普通切片和超薄切片，分別在光鏡和電鏡下觀察其組織病理變化特征。 3．從視網(wǎng)膜中提取蛋白質(zhì)并純化和測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，經(jīng)固相pH梯度等電聚焦、平衡、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、凝膠染色和圖像掃描，建立正常視網(wǎng)膜及8周糖尿病大鼠視網(wǎng)膜蛋白質(zhì)表達(dá)譜。對(duì)影響2-DE結(jié)果的各種因素進(jìn)行調(diào)整、優(yōu)化。

4、 4．用PDQuest 7.3.1軟件進(jìn)行圖像剪切和優(yōu)化處理，以及點(diǎn)的檢測(cè)和計(jì)數(shù)，分析糖尿病性視網(wǎng)膜的蛋白質(zhì)的差異表達(dá)情況。 5．對(duì)表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的蛋白質(zhì)進(jìn)行膠內(nèi)原位酶解和串聯(lián)質(zhì)譜(tandem mass spectrometry，MS/MS)鑒定，所得結(jié)果用GPS-MASCOT進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索。 6．對(duì)鑒定出來的蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。 7．探討差異表達(dá)蛋白質(zhì)在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變過程中的作用，以及它

5、們的臨床意義。 結(jié)果： 1．8周病程糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜光鏡結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)未見明顯改變。 2．成功獲得了糖尿病大鼠視網(wǎng)膜及正常視網(wǎng)膜組織蛋白質(zhì)的雙向凝膠電泳圖譜，建立了穩(wěn)定的2-DE技術(shù)。 3．經(jīng)分析比較獲得 36 個(gè)表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，包括上調(diào)5個(gè)，下調(diào)23個(gè)，消失8個(gè)。 4．對(duì)其中8個(gè)差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，其中表達(dá)上調(diào)的有晶狀體蛋白β A1(預(yù)測(cè))(predi

6、cted crystallin beta A1)和晶狀體蛋白αB (Crystallin alpha B)，表達(dá)下調(diào)的有白蛋白 (albumin)、二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶2 (dimethylarginine dimethylaminohydrolase 2，DDAH Ⅱ)、磷酸丙糖異構(gòu)酶-1 (triosephosphate isomerase 1，’TIM-1)、ATP 合酶 d 鏈(ATPsynthase，H<'+>tran

7、sporting，mitochondrial FO complex,subunit d)和鳥苷酸激酶-1 (預(yù)測(cè))(predicted guanylate kinase 1，GK-1)，表達(dá)消失的有過氧還原素6(Peroxiredoxin 6，Prdx 6)。 5．差異表達(dá)譜生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，作為小熱休克蛋白的晶狀體蛋白αB 為細(xì)胞保護(hù)的分子侶伴蛋白，在細(xì)胞骨架的保護(hù)和調(diào)節(jié)以及抗凋亡方面有重要作用。我們首次報(bào)道了它在糖尿病

8、視網(wǎng)膜組織中高表達(dá)，可能作為DR診治和預(yù)后的重要生化標(biāo)記物。 白蛋白是哺乳動(dòng)物脈管系統(tǒng)中最豐富的轉(zhuǎn)運(yùn)和貯存蛋白，可調(diào)節(jié)血漿膠體滲透壓，增大血管內(nèi)徑，尤其是小動(dòng)脈或毛細(xì)血管。它在抗氧化方面和NO信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中有重要作用。在糖尿病視網(wǎng)膜組織中低表達(dá)的白蛋白可能影響到血漿膠體滲透壓和NO信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，加重視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡，最終導(dǎo)致失明。 二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶2(DDAH Ⅱ)能水解二甲基精氨酸(ADMA)和一甲基精氨酸(MM

9、A)，從而影響NO的產(chǎn)生，糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中DDAH Ⅱ的下調(diào)能增加ADMA，降低NO合成，保護(hù)視網(wǎng)膜細(xì)胞免受高血糖的損傷。 磷酸丙糖異構(gòu)酶-1(TIM-1)參與糖酵解，糖分解成丙酮酸鹽的反應(yīng)鏈涉及到10種酶，其中TIM-1為第5種酶，能將DHAP轉(zhuǎn)化為GAP。高血糖能增加TIM-1．的硝化，導(dǎo)致TIM-1的低表達(dá)，從而減少了ATP的合成。TIM-1有可能作為DR診治的有用標(biāo)記物。 鳥苷酸激酶-1(GK-1) 能催化AT

10、P依賴的GMP變成GDP，參與GMP循環(huán)，最終影響cGMP的水平，在視桿細(xì)胞的感光換能過程中起了重要作用。糖尿病視網(wǎng)膜組織中低表達(dá)的GK-1增加了GMP水平，使cGMP蓄積，最終影響到神經(jīng)沖動(dòng)的產(chǎn)生，這有可能是DR致盲的一種可能機(jī)制。 ATP合酶d亞單位能催化合成ATP，但具體功能不清。糖網(wǎng)病視網(wǎng)膜中ATP合酶d亞單位的低表達(dá)會(huì)使ATP合成減少，影響到視網(wǎng)膜細(xì)胞的功能。過氧還原素6 (Prdx 6)是唯一同時(shí)具有GSH過氧化物酶

11、和磷脂酶A2活性的雙功能蛋白，能防止氧化應(yīng)激。糖尿病視網(wǎng)膜中Prdx 6的消失可能會(huì)加重組織的氧化損傷。 晶狀體蛋白β A1與眼內(nèi)壓的增高有關(guān)，但在非晶狀體組織中的作用目前尚不清楚。 結(jié)論： 1．已建立的視網(wǎng)膜蛋白質(zhì)2-DE技術(shù)將為進(jìn)一步開展視網(wǎng)膜疾病的蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。 2．8周病程糖尿病大鼠視網(wǎng)膜未見明顯組織結(jié)構(gòu)改變，但已經(jīng)有蛋白質(zhì)表達(dá)的差異，提示糖尿病視網(wǎng)膜的蛋白質(zhì)表達(dá)改變先于組織學(xué)改變。

12、 3．這些表達(dá)有差異的蛋白質(zhì)，包括晶狀體蛋白αB、白蛋白、 DDAH II、TIM-1、GK-1、Prdx 6和ATP合酶d鏈等，在細(xì)胞骨架保護(hù)和調(diào)節(jié)、抗凋亡、抗氧化、NO信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、感光換能作用、糖酵解、ATP合成、氧化應(yīng)激等方面起著重要作用，可能參與糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機(jī)制，有助于糖尿病視網(wǎng)膜病變的診斷和治療。 4．早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織學(xué)結(jié)構(gòu)無明顯變化，但蛋白質(zhì)表達(dá)出現(xiàn)較大的變化，涉及的蛋白質(zhì)種類較多，與以往基因組研