2型糖尿病大鼠神經(jīng)視網(wǎng)膜損傷蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最為常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥，是當(dāng)今世界上中老年齡段人群主要致盲性眼病之一。資料表明，糖尿病患者中，DR的發(fā)病率高達(dá)50％。15年病程的糖尿病患者，大約有10％因視網(wǎng)膜病變而有嚴(yán)重視力障礙，約2％成為盲目。 應(yīng)用傳統(tǒng)的研究方法，雖然已經(jīng)初步揭示了DR的病理過(guò)程和部分相關(guān)機(jī)制，但是，缺乏對(duì)其復(fù)雜的生化和分子機(jī)制的全面了解。在臨床上，對(duì)DR的預(yù)防和治療，至今還沒(méi)有理想

2、的措施。蛋白質(zhì)組學(xué)作為一門(mén)新興學(xué)科，著重于從整體水平上研究生物體的功能。應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法能夠全面揭示組織或細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)狀況。通過(guò)比較正常和疾病狀態(tài)下表達(dá)蛋白的差異，可揭示參與DR病理過(guò)程的多種因子和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)新的與DR病理過(guò)程相關(guān)的蛋白。該技術(shù)對(duì)深入、系統(tǒng)的研究DR發(fā)生發(fā)展的病理機(jī)制，確定有效預(yù)防和治療藥靶方面有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。 本研究第一部分，對(duì)SD大鼠神經(jīng)視網(wǎng)膜進(jìn)行分離，并用組織學(xué)和透射電鏡方法鑒定所分離的組織

3、，提取組織總蛋白，應(yīng)用二維電泳(two-dimensional gel electrophoresis，2DE)技術(shù)對(duì)提取的蛋白進(jìn)行分離，摸索各個(gè)實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)的條件，獲得了分辨率高和重復(fù)性好的2DE圖像，建立了2DE分離技術(shù)的平臺(tái)，為進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。 本研究的第二部分，用高脂飲食聯(lián)合小劑量STZ(streptozotocin，STZ)腹腔注射建立大鼠2型糖尿病模型。以年齡匹配正常SD大鼠為對(duì)照。分離神經(jīng)視網(wǎng)膜組織，提取組織總蛋

4、白。2DE分離蛋白質(zhì)，應(yīng)用銀染或考馬斯蘭染色方法顯示分離的蛋白質(zhì)。通過(guò)計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)對(duì)凝膠圖像進(jìn)行處理，在24cm，pH3-10的膠體上，正常組平均每塊膠檢測(cè)到3122±37(n=3)個(gè)蛋白點(diǎn)；糖尿病組，平均每塊膠檢測(cè)到2702±21(n=3)個(gè)蛋白點(diǎn)，平均匹配率為76.8％。大部分蛋白質(zhì)點(diǎn)分布在pI 4-8和分子量14.4-64.4KD區(qū)域。與正常組比較，表達(dá)有明顯差異的約150個(gè)蛋白點(diǎn)。在糖尿病組表達(dá)上調(diào)的點(diǎn)68個(gè)，下調(diào)的點(diǎn)82

5、個(gè)。 采用肽質(zhì)量指紋譜(peptide mass fingerprinting，PMF)和串聯(lián)質(zhì)譜肽序列分析方法對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行鑒定。經(jīng)鑒定，得分值較高的20個(gè)蛋白質(zhì)中，有10個(gè)為新發(fā)現(xiàn)的蛋白，值得進(jìn)一步研究。初步分析表明，差異蛋白質(zhì)的功能涉及糖代謝和脂代謝、炎癥反應(yīng)、NO合酶途徑以及細(xì)胞骨架蛋白和分子伴侶蛋白等。 本研究第三部分，應(yīng)用western blot方法和間接免疫熒光(immunofluoresce，IMF)

6、方法顯示糖尿病大鼠神經(jīng)視網(wǎng)膜組織αA-晶體蛋白表達(dá)上調(diào)。IMF顯示αA-晶體蛋白主要分布在視網(wǎng)膜核層。 驗(yàn)證了2DE的結(jié)果。本研究第四部分，應(yīng)用組織學(xué)方法顯示早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞密度降低。視網(wǎng)膜消化鋪片方法沒(méi)有發(fā)現(xiàn)微血管周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞有明顯異常變化。提供了糖尿病早期視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞退行性病變的依據(jù)。 本研究應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)和方法，分離和鑒定了早期糖尿病大鼠神經(jīng)視網(wǎng)膜差異表達(dá)蛋白。發(fā)現(xiàn)了一些新蛋白。用west