糖尿病大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)病變的研究.pdf

1、目的： 1.建立正常大鼠視網(wǎng)膜和8周糖尿病大鼠視網(wǎng)膜基因差異表達(dá)譜，并通過生物信息學(xué)方法對(duì)表達(dá)譜進(jìn)行分析，初步篩選糖尿病視網(wǎng)膜病變相關(guān)基因。 2.進(jìn)一步驗(yàn)證糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中相關(guān)因子在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)變化，并對(duì)相關(guān)因子進(jìn)行視網(wǎng)膜組織學(xué)定位，探索其在視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá)變化情況，為揭示糖尿病視網(wǎng)膜病變的病理機(jī)制提供依據(jù)。 方法： 1.sD大鼠腹腔注射四氧嘧啶制備糖尿病動(dòng)物

2、模型。采用限制片段差異顯示聚合酶鏈反應(yīng)(Restriction Fragment Differential Display- Pol ymerase Chained Reaction，RFDD-PCR)技術(shù)平行操作，建立正常視網(wǎng)膜及8周糖尿病大鼠視網(wǎng)膜兩個(gè)基因表達(dá)譜。 2.以7％尿素變性聚丙烯酰胺電泳進(jìn)行表達(dá)差異基因片段的分離顯示，結(jié)合http://www.Qgene.com/display/數(shù)據(jù)庫資料，應(yīng)用ImageTool，

3、ImageQuant TL等軟件，對(duì)各組織間有表達(dá)差異的基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，篩選糖尿病候選基因。 3．通過半定量RT-PCR、Rea1-time RT-PCR、Western B10t、免疫組織化學(xué)技術(shù)進(jìn)一步觀察候選基因在8周糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中的表達(dá)。 結(jié)果： 1．建立了糖尿病大鼠視網(wǎng)膜及正常大鼠視網(wǎng)膜基因表達(dá)譜：共獲得有意義的表達(dá)片段3639個(gè)，包括DR：1826個(gè)，NR：1813個(gè)。有差異的片段840。與正常相比

4、糖尿病狀態(tài)下表達(dá)信號(hào)減弱的基因片段283個(gè)，增強(qiáng)的225個(gè)，消失的145個(gè)，出現(xiàn)的187個(gè)； 2．差異表達(dá)譜生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，糖尿病狀態(tài)下：1)NOS： eNOS和nNOS表達(dá)有不同程度下調(diào)，iNOS表達(dá)明顯上調(diào)：2) ET 及ETR： ET-1、ET-3、ETRB和ECE表達(dá)均不同程度上調(diào)，ET-2和ETRA本次實(shí)驗(yàn)中未能檢出；3)synuclein：α-synuclein表達(dá)明顯上調(diào)，β-synuclein和γ-syn

5、uclein表達(dá)無變化。 3．半定量RT-PCR結(jié)果顯示：1)NOS：與正常視網(wǎng)膜相比，糖尿病8周大鼠視網(wǎng)膜eNOS和nNOS表達(dá)明顯下調(diào)，iNOS表達(dá)明顯上調(diào)；2)ET及ETR：與正常視網(wǎng)膜相比，糖尿病8周大鼠視網(wǎng)膜ET-1、ET-2、ET-3、 ETRA、ETRB和ECE表達(dá)均明顯上調(diào)。 4．Real-time RT-PCR結(jié)果顯示：與正常視網(wǎng)膜相比，8周糖尿病大鼠視網(wǎng)膜α-synuclein，β-synuclein

6、和γ-synuclein表達(dá)明顯上調(diào)。 5．半定量Western B1ot 結(jié)果顯示：1)3-NT和NOS：與正常視網(wǎng)膜相比，糖尿病8周大鼠視網(wǎng)膜eNOS和nNOS蛋白水平明顯降低，3-NT和iNOS蛋白水平明顯升高：2)ET及ETR：與正常視網(wǎng)膜相比，糖尿病8周大鼠視網(wǎng)膜ET、ETRA和ETRB蛋白水平均明顯增強(qiáng)；3)α-synuclein：與正常視網(wǎng)膜相比，8周糖尿病大鼠視網(wǎng)膜α-synuclein蛋白水平均明顯增強(qiáng)。

7、 6．免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：1)3-NT和NOS：與正常視網(wǎng)膜相比，8周糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中，INL的3-NT和iNOS免疫陽性細(xì)胞明顯增多，INL和血管內(nèi)皮層的eNOS陽性細(xì)胞明顯減少，INL的nNOS陽性細(xì)胞也明顯減少；2)ET及ETR：與正常視網(wǎng)膜相比，8周糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中，ET、ETRA、ETRB 免疫陽性細(xì)胞明顯增多，增多的陽性細(xì)胞主要集中于INL，而在血管內(nèi)皮層增多不明顯；3)α-synuclein：與正常視網(wǎng)膜相比，8周

8、糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中，α-synuclein免疫陽性細(xì)胞明顯增多，增多的陽性細(xì)胞主要集中于視網(wǎng)膜視錐視桿層。 結(jié)論： 1．RFDD-PCR 技術(shù)可以檢測出大量表達(dá)基因，適用于疾病差異表達(dá)譜分析，可以初篩疾病相關(guān)基因。 2．8周糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中，eNOS和nNOS的表達(dá)降低提示視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞已受到損害，INL和GCL的3-NT免疫陽性反應(yīng)的出現(xiàn)和iNOS表達(dá)的增強(qiáng)進(jìn)一步提示8周糖尿病大鼠神經(jīng)視網(wǎng)膜