RSV感染對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞炎癥和基質(zhì)粘附功能的影響.pdf

1、目的：
　　近年來氣道上皮的功能逐漸引起人們的關(guān)注。人們開始認(rèn)識(shí)到氣道上皮不僅僅是一個(gè)能隔離外界環(huán)境中微粒和氣溶膠的機(jī)械屏障，還是一層粘膜免疫屏障，是對(duì)抗環(huán)境中的損傷如病毒和顆粒性物質(zhì)的第一線結(jié)構(gòu)性細(xì)胞防御機(jī)制。正常情況下，氣道上皮主要是保持氣道開放以及結(jié)構(gòu)完整，從而保持局部微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。當(dāng)氣道受到過敏原、病毒和物理性損傷等刺激時(shí)，氣道上皮細(xì)胞既能作為靶細(xì)胞受到外源性物質(zhì)的影響，也作為效應(yīng)細(xì)胞，通過合成和表達(dá)一系列分子，包括粘附分

2、子以及可溶性分子如細(xì)胞因子和趨化因子等來參與天然免疫反應(yīng)。然后，天然免疫反應(yīng)的活化引起免疫細(xì)胞聚集到氣道上皮，啟動(dòng)獲得性免疫反應(yīng)。越來越多的人認(rèn)識(shí)到氣道上皮細(xì)胞在氣道天然免疫和獲得性免疫以及粘膜炎癥中發(fā)揮著核心作用。
　　粘附分子在氣道上皮細(xì)胞上的正常表達(dá)對(duì)于保持氣道微環(huán)境穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。細(xì)胞間粘附分子-1(intercellular adhesion molecule，ICAM-1)是免疫球蛋白基因超家族的一個(gè)成員，是氣道上皮反應(yīng)

3、的一個(gè)重要組成部分。ICAM-1是誘導(dǎo)免疫反應(yīng)和炎癥病理機(jī)制的基本組分，通過與白細(xì)胞表面的相應(yīng)配體結(jié)合，介導(dǎo)白細(xì)胞滲出。ICAM-1還具有信號(hào)分子的功能，傳遞胞外—胞內(nèi)信號(hào)，產(chǎn)生大量的生物學(xué)效應(yīng)，如誘導(dǎo)胞內(nèi)蛋白磷酸化，使蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子活化。另外，粘附分子在介導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞之間以及細(xì)胞與基質(zhì)蛋白之間的連接中發(fā)揮重要作用。E-cadherin屬于鈣粘素分子家族，是一種同親型結(jié)合、鈣依賴性細(xì)胞粘著糖蛋白，通常表達(dá)在上皮細(xì)胞。α-、β-、γ

4、-連環(huán)蛋白(catenin)能與E-cadherin胞漿區(qū)結(jié)合并將其連接至肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架，維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。E-cadherin介導(dǎo)的粘著連接(adherensjunctions，AJs)斷裂與上皮完整性丟失有關(guān)。有研究表明，用抗體選擇性阻斷E-cadherin能減小原代培養(yǎng)的氣道上皮跨上皮電阻達(dá)80％以上，提示E-cadherin對(duì)于保持氣道上皮屏障完整的重要性。
　　呼吸道合胞病毒（Respiratory Syncytia

5、l Virus，RSV）是世界范圍內(nèi)兒童流行性呼吸道疾病以及嬰幼兒、老年人和免疫功能低下患者細(xì)支氣管炎和肺炎的首要發(fā)病原因。世界衛(wèi)生組織2009年9月更新的數(shù)據(jù)顯示，病毒感染引起的呼吸道疾病中RSV感染占據(jù)首位。全球每年由RSV感染引發(fā)的病例約達(dá)6400萬，并引起約16萬人死亡。RSV主要感染氣道上皮細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，引起氣道上皮細(xì)胞壞死、脫落以及粘膜腐脫，伴隨大量的炎癥介質(zhì)釋放，啟動(dòng)免疫和病理反應(yīng)，使氣道上皮結(jié)構(gòu)遭到破壞和功能發(fā)

6、生缺陷，成為引起RSV相關(guān)疾病的始動(dòng)環(huán)節(jié)。RSV感染誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞產(chǎn)生一系列基因和/或基因產(chǎn)物，如ICAM-1、細(xì)胞因子、趨化因子和其他炎癥介質(zhì)等發(fā)揮宿主防御功能，啟動(dòng)抗病毒和炎癥反應(yīng)。同時(shí)，RSV感染能引起氣道上皮損傷，上皮頂端連接復(fù)合物斷裂以及肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重構(gòu)，跨上皮電阻減小，提示氣道上皮的完整性遭到破壞。另一方面，呼吸道合胞病毒也擁有許多可表達(dá)的基因，能對(duì)抗Ⅰ型干擾素作用和其他有關(guān)的宿主抑制病毒復(fù)制的途徑。病毒感染通過對(duì)宿主

7、蛋白功能的特異拮抗作用、RNA應(yīng)激顆粒的誘導(dǎo)以及宿主基因表達(dá)模式改變的誘導(dǎo)，能改變宿主基因的轉(zhuǎn)錄以及宿主轉(zhuǎn)錄本的翻譯?？梢?，上皮細(xì)胞與RSV之間的相互作用是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，即疾病持續(xù)或病情進(jìn)展依賴于上皮細(xì)胞是否能有效清除病毒。
　　RSV感染除了會(huì)引起急性臨床癥狀外，還認(rèn)為其與一些長期存在的并發(fā)癥有關(guān)，如反復(fù)發(fā)作的哮喘和哮喘病。在急性癥狀治愈之后，RSV感染引起的長期存在的氣道功能不全機(jī)制，目前尚不清楚。綜上所述，我們推測RSV急

8、性感染后長期存在的氣道功能不全可能與氣道上皮細(xì)胞粘附分子表達(dá)異常從而危害氣道上皮屏障功能有關(guān)。為了揭示RSV感染對(duì)氣道上皮的長期影響，本課題利用一種轉(zhuǎn)化的人支氣管上皮細(xì)胞(human bronchial epithelial cells)——16HBECs，試圖探討RSV能否感染16HBECs持續(xù)至若干代，在此基礎(chǔ)上觀察細(xì)胞炎癥粘附和基質(zhì)粘附功能的動(dòng)態(tài)變化，并初步探討其分子機(jī)制，對(duì)揭示RSV急性感染后長期存在的氣道功能障礙發(fā)展規(guī)律具有重

9、要作用，也有可能為其治療提供新的思路。
　　研究內(nèi)容如下:
　　(1)利用16HBECs建立RSV長期感染模型，分析RSV在16HBECs中的復(fù)制情況以及細(xì)胞對(duì)RSV感染的敏感性。
　　(2)利用建立的RSV體外感染16HBECs持續(xù)4代模型，觀察RSV感染后16HBECs炎癥粘附功能和基質(zhì)粘附功能的動(dòng)態(tài)變化。
　　(3)分析ICAM-1和E-cadherin對(duì)RSV感染后16HBECs粘附功能的影響，初步探討粘

10、附功能改變的分子機(jī)制。
　　方法與結(jié)果：
　　1.建立人支氣管上皮細(xì)胞株16HBECs RSV長期感染模型分別用感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)為0.00025、0.0005、0.0010、0.0067、0.0134、0.0268和0.0536的RSV(A2株)感染16HBECs，觀察不同MOI對(duì)細(xì)胞傳代、細(xì)胞病變和RSV病毒復(fù)制的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)RSV在MOIs≤0.0010感染1

11、6HBECs時(shí)，光鏡下偶見第3代(generation，G)和G4極少量合胞細(xì)胞;G1細(xì)胞中能檢測到RSV RNA，G2開始至G20 Real-time PCR結(jié)果均顯示RSV核酸陰性。當(dāng)RSV在MOI=0.0067感染16HBECs時(shí)，有時(shí)G2或G3細(xì)胞死亡或病毒被清除;但多數(shù)情況下（約80％）細(xì)胞能傳至G4，此時(shí)G1、G2未見明顯的細(xì)胞形態(tài)變化，G3可見少量小的合胞細(xì)胞和形狀不規(guī)則細(xì)胞，G4可觀察到大的合胞細(xì)胞以及細(xì)胞數(shù)量減少，G5

12、則以裂解細(xì)胞為主，伴隨一些合胞細(xì)胞及散在的細(xì)胞貼在培養(yǎng)瓶/皿上，細(xì)胞很快死亡;核酸檢測結(jié)果與之相符，G2細(xì)胞RSV RNA即為陽性，且傳代過程中CT值逐漸減小。RSV在MOIs≥0.0134感染16HBECs時(shí)，G3即可見大量合胞細(xì)胞，引起細(xì)胞大量死亡;此時(shí)G2細(xì)胞RSV核酸檢測即為陽性，且傳代過程中的GT值逐漸減小。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用RSV在MOI=0.0067感染16HBECs，傳至第5代細(xì)胞死亡時(shí)，用G1至G4細(xì)胞進(jìn)行分析。

13、>　　第一部分結(jié)果說明16HBECs對(duì)RSV A2特別敏感，當(dāng)細(xì)胞單層培養(yǎng)時(shí)，病毒能在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行有效復(fù)制。我們建立了一個(gè)RSV(A2株)體外感染16HBECs持續(xù)4代模型，可用于分析細(xì)胞的炎癥粘附和基質(zhì)粘附情況。
　　2.RSV感染后16HBECs炎癥粘附和基質(zhì)粘附功能的動(dòng)態(tài)變化利用RSV（A2株）體外感染16HBECs持續(xù)4代模型，觀察細(xì)胞炎癥粘附和基質(zhì)粘附功能的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果顯示，RSV感染后，能夠上調(diào)一系列細(xì)胞因子和趨化因子

14、的分泌。白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6從G2至G4進(jìn)行性升高;IL-1β、IL-8、腫瘤壞死因子(tumornecrosis factor, TNF)-α和巨噬細(xì)胞炎癥蛋白（macrophageinflammatory protein，MIP）-1α在G3和G4升高;而干擾素-γ誘導(dǎo)蛋白（interferon-γ-induced protein，IP）-10僅在G4升高。這些細(xì)胞因子和趨化因子的分泌均在G4達(dá)到高峰，且其

15、分泌量為G3細(xì)胞的數(shù)倍至數(shù)十倍。RSV感染后，G1細(xì)胞和正常細(xì)胞比較，與白細(xì)胞的粘附率無顯著差異;但從G2開始顯著并逐步升高，G4達(dá)高峰。同時(shí)分析細(xì)胞的基質(zhì)粘附功能發(fā)現(xiàn)，16HBECs G1和G2與正常對(duì)照組相比，細(xì)胞的基質(zhì)粘附率沒有顯著差異;而G3和G4細(xì)胞與基質(zhì)的粘附率顯著下降。
　　第二部分的結(jié)果說明RSV感染16HBECs初期細(xì)胞的炎癥介質(zhì)分泌量、炎癥粘附功能和基質(zhì)粘附功能均沒有明顯變化，提示輕微RSV感染早期是疾病控制和

16、預(yù)防的最好時(shí)機(jī)。但在RSV長期感染過程中，16HBECs細(xì)胞因子/趨化因子的分泌顯著增加、白細(xì)胞粘附功能顯著增強(qiáng)而基質(zhì)粘附能力顯著下降，且均在G4達(dá)到高峰。提示RSV感染引起16HBECs發(fā)生一系列復(fù)雜的事件，引起了炎癥反應(yīng)的動(dòng)員和上皮完整性的丟失，這種上皮功能和結(jié)構(gòu)完整性的缺陷，是引起細(xì)胞死亡的根本原因。
　　3.ICAM-1和E-cadherin對(duì)RSV感染后16HBECs粘附功能的影響在檢測RSV感染后16HBECs粘附分子

17、ICAM-1和E-cadherin表達(dá)情況的基礎(chǔ)上，利用抗體阻斷實(shí)驗(yàn)觀察它們對(duì)RSV感染后16HBECs粘附功能的影響。結(jié)果顯示，RSV感染后，除G1細(xì)胞外，ICAM-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高，G4達(dá)到高峰（分別為正常對(duì)照組的6.3和6.7倍）。全細(xì)胞半定量測定也證實(shí)了這一結(jié)果，除G1細(xì)胞外，ICAM-1的表達(dá)水平顯著升高，G4達(dá)到高峰（約為正常對(duì)照組的22.9倍）;可溶性ICAM-1（soluble ICAM-1，sICA

18、M-1）在G1和G2均未見明顯升高，而G3和G4細(xì)胞分泌sICAM-1顯著增加，G4達(dá)到高峰（約為正常對(duì)照組的25.2倍）。RSV感染后，從G1開始，16HBECs E-cadherin基因CDH1 mRNA的表達(dá)水平即顯著升高，到G3達(dá)到高峰（約為正常對(duì)照組的12.4倍），但G4有所下降。與正常對(duì)照組相比，G2和G3細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著升高，但G4顯著下降，Western blot法幾乎不能檢測到E-cadheri

19、n蛋白的存在?？贵w阻斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與G3對(duì)照組相比，ICAM-1中和抗體能顯著抑制RSV誘導(dǎo)的16HBECs TNF-α的分泌，而對(duì)IL-1β、IL-6、IL-8、MIP-1α和IP-10的分泌沒有顯著影響;ICAM-1中和抗體還能顯著降低16HBECs與白細(xì)胞的粘附率;而用抗體選擇性阻斷E-cadherin能顯著抑制16HBECs與基質(zhì)的粘附。
　　第三部分結(jié)果說明RSV長期感染引起16HBECs粘附分子ICAM-1和E-ca

20、dherinr的表達(dá)發(fā)生異常改變，參與了細(xì)胞炎癥反應(yīng)的動(dòng)員以及上皮完整性的丟失。
　　結(jié)論：
　　本研究首次探討了呼吸道合胞病毒A2株體外持續(xù)感染16HBECs的可行性，發(fā)現(xiàn)人支氣管上皮細(xì)胞(16HBECs)對(duì)RSV A2株特別敏感，建立了一個(gè)RSV（A2株）體外感染16HBECs持續(xù)4代模型?；诖四Ｐ偷倪M(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在RSV長期感染過程中，病毒引起了細(xì)胞粘附分子表達(dá)的改變、炎癥反應(yīng)的動(dòng)員和細(xì)胞脫落，從而導(dǎo)致了細(xì)胞的死亡