甲醛染毒對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞炎性因子影響及作用機(jī)制研究.pdf

1、【目的】
　　通過(guò)不同濃度甲醛染毒人支氣管上皮細(xì)胞16HBE，檢驗(yàn)甲醛對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞16HBE毒性，研究甲醛致哮喘機(jī)制中Th1/Th2/Th17類與TNF-α細(xì)胞因子間的變化規(guī)律與NF-κB、COX-2、JNK、ERK蛋白表達(dá)水平的影響，確定評(píng)估甲醛致哮喘作用及相關(guān)炎性因子生物標(biāo)志物，探討甲醛致哮喘作用機(jī)制。
　　【方法】
　　1、甲醛染毒人支氣管上皮細(xì)胞16HBE增殖活性實(shí)驗(yàn)
　　取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)細(xì)胞接種于9

2、6孔板上，在37°，5％CO2條件下培養(yǎng)至細(xì)胞單層鋪滿孔底，按實(shí)驗(yàn)要求分6組甲醛染毒24小時(shí)（甲醛染毒濃度分別為0.04、0.08、0.16、0.32、0.64mmol/l，用無(wú)血清1640培養(yǎng)基與甲醛分析純配置），每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)平行孔，用MTT法檢測(cè)人支氣管上皮細(xì)胞16HBE增殖活性并檢測(cè)半數(shù)致死量LC50。
　　2、人支氣管上皮細(xì)胞急性甲醛染毒2、4小時(shí)后細(xì)胞上清液中Th1類細(xì)胞因子變化研究
　　取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)16 HB

3、E細(xì)胞接種于48孔板上，用無(wú)血清培養(yǎng)基、不同濃度甲醛溶液（用無(wú)血清培養(yǎng)基配至濃度為0.04、0.16、0.64、1.2 mmol/l）染毒后，在37°，5%CO2無(wú)菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2、4小時(shí)后取細(xì)胞上清液高速離心后用ELISA試劑盒測(cè)Th1類細(xì)胞（IL-2、IL-10、IL-12、IFN-γ）因子含量研究人支氣管上皮細(xì)胞急性甲醛染毒后Th1類細(xì)胞因子作用變化。
　　3、人支氣管上皮細(xì)胞急性甲醛染毒2、4小時(shí)后細(xì)胞上清液中Th2類細(xì)胞

4、因子變化研究
　　取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)16HBE細(xì)胞接種于48孔板上，用無(wú)血清培養(yǎng)基、不同濃度甲醛溶液（用無(wú)血清培養(yǎng)基配至濃度為0.04、0.16、0.64、1.2 mmol/l）染毒后，在37°，5%CO2無(wú)菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2、4小時(shí)后取細(xì)胞上清液高速離心后用ELISA試劑盒測(cè)Th2類細(xì)胞因子（IL-4、IL-5、IL-6、IL-13）含量研究人支氣管上皮細(xì)胞急性甲醛染毒后Th2類細(xì)胞因子作用變化。
　　4、人支氣管上皮細(xì)胞急性甲

5、醛染毒2、4小時(shí)后細(xì)胞上清液中Th17類與TNF-α細(xì)胞因子變化研究
　　取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)16HBE細(xì)胞接種于48孔板上，用無(wú)血清培養(yǎng)基、不同濃度甲醛溶液（用無(wú)血清培養(yǎng)基配至濃度為0.04、0.16、0.64、1.2 mmol/l）染毒后，在37°，5%CO2無(wú)菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2、4小時(shí)后取細(xì)胞上清液高速離心后用ELISA試劑盒測(cè)Th17（IL-8、IL-17）與TNF-α細(xì)胞因子含量研究人支氣管上皮細(xì)胞急性甲醛染毒后Th17類及TN

6、F-α細(xì)胞因子作用變化。
　　5、用WESTERN BLOT法檢測(cè)甲醛染毒后16HBE細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白NF-κB、COX-2、ERK表達(dá)變化
　　取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)16HBE細(xì)胞接種于6孔板上，用無(wú)血清培養(yǎng)基、不同濃度甲醛溶液（用無(wú)血清培養(yǎng)基配至濃度為0.04、0.16、0.32、0.64、1.2 mmol/l）染毒后，在37°，5% CO2無(wú)菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2、4小時(shí)后提取細(xì)胞總蛋白后用 WESTERN BLOT法測(cè)NF-κ

7、B、COX-2、ERK的表達(dá)含量。
　　【結(jié)果】
　　1、人支氣管上皮細(xì)胞（16HBE）的細(xì)胞存活率與甲醛染毒劑量成反比關(guān)系。與對(duì)照組（0mmol/l）相比，0.32、0.64mmol/l劑量組的細(xì)胞存活率下降明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。甲醛對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞（16HBE）的半數(shù)致死量濃度為0.4658mmol/l。
　　2、TH1類細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果顯示：2小時(shí)甲醛染毒時(shí)，與對(duì)照組（0.00 mmol/l）

8、相比，0.04、0.16mmol/l甲醛染毒劑量組細(xì)胞上清液中IL-2含量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），IFN-γ、IL-12組間變化均不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；4小時(shí)甲醛染毒時(shí)，與對(duì)照組（0.00 mmol/l）相比，甲醛染毒劑量組內(nèi)IL-2、 IL-12含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與對(duì)照組（0.00 mmol/l）相比，IFN-γ組間變化不明顯差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　

9、3、TH2類細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果顯示：2小時(shí)甲醛染毒時(shí)，與對(duì)照組（0.00 mmol/l）相比，染毒劑量組細(xì)胞上清液 IL-5含量升高，IL-6含量呈下降趨勢(shì)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），IL-4、IL-10、IL-13組間變化不明顯差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；4小時(shí)甲醛染毒時(shí)，與對(duì)照組（0.00 mmol/l）相比，1.2mmol/l劑量組內(nèi)IL-4含量升高，0.04、0.16、0.64劑量組內(nèi)IL-5含量升高，1.2mmo

10、l/l劑量組內(nèi)的IL-5含量降低、IL-6組間含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P<0.05）， IL-10、IL-13組間變化不明顯差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　4、TH17類與TNF-α細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果顯示：2小時(shí)甲醛染毒時(shí)，與對(duì)照組（0.00 mmol/l）相比，染毒劑量組細(xì)胞上清液內(nèi) IL-8含量呈下降趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），IL-17、TNF-α組間變化不明顯差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；4小時(shí)甲醛染

11、毒時(shí)，經(jīng)多因素方差分析，與對(duì)照組（0.00 mmol/l）相比，0.04、0.16mmol/l劑量組內(nèi)IL-8含量升高，繼續(xù)加大甲醛濃度后IL-8含量減少，各組間TNF-α含量均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），IL-17組間含量變化不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　5、不同濃度的甲醛能明顯上調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）、COX-2的蛋白表達(dá)水平，并在一定程度上呈現(xiàn)劑量反應(yīng)關(guān)系，但是對(duì)甲醛對(duì)ERK蛋白含量的表達(dá)并

12、無(wú)明顯的影響
　　【結(jié)論】
　　1、低劑量的甲醛對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞增殖率有一定影響，當(dāng)劑量加大時(shí)，會(huì)引起細(xì)胞死亡。
　　2、急性甲醛染毒可降低Th1類IL-2、IL-12含量，升高Th2類IL-4、IL-5含量，升高Th17類IL-8含量，升高TNF-α含量，加重氣道炎癥，從而促進(jìn)哮喘的發(fā)生發(fā)展。
　　3、急性甲醛染毒可通過(guò)上調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）、COX-2、JNK、ERK的蛋白表達(dá)水平，促進(jìn)炎性細(xì)胞的分泌