氧化應(yīng)激對支氣管上皮細胞CFTR門控功能及調(diào)控機制研究.pdf

1、目的： 在氣道炎癥或氣道高反應(yīng)(airway hyperresponsiveness，AHR)中，氣道粘液分泌量異常增多，粘液組成成分也發(fā)生改變，容易形成氣道粘液栓，是氣道阻力增高的重要病理機制。氣道上皮細胞粘液分泌的數(shù)量及組成成分取決于某些離子通道的功能活性及表達密度，其中囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(Cystic fibrosis transmembraneconductance regulator，CFTR)尤為人們所關(guān)注。

2、CFTR是一種磷酸化調(diào)控的上皮細胞Cl-通道，主要位于氣道上皮細胞頂側(cè)膜，借助其對Cl-的跨膜轉(zhuǎn)運，在跨上皮鹽類物質(zhì)轉(zhuǎn)運、水分流動和離子濃度調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。CFTR功能缺陷的患者分泌的粘液成分也與正常人很不一樣，粘液包含有細菌感染產(chǎn)物、粘液脂質(zhì)、肌動蛋白、蛋白酶等，使得其含有更多的非蒸發(fā)性的固體成分，增加粘液的稠度，降低粘液清除率和粘液運輸效率，容易誘發(fā)氣道炎癥和形成氣道粘液栓?；谝陨系牟糠志€索，本課題提出“氣道上皮細胞CFTR門

3、控功能及表達調(diào)節(jié)參與氣道功能穩(wěn)態(tài)，其缺陷可能與AHR形成機制有關(guān)”。 方法與結(jié)果： 1)氧化應(yīng)激抑制支氣管上皮細胞CFTR表達及信號機制 我們用臭氧連續(xù)應(yīng)激大鼠3天，每天1小時建立氣道高反應(yīng)動物模型，免疫熒光結(jié)果顯示，正常大鼠支氣管上皮頂膜及胞漿中可見較多的紅色染色的CFTR，而臭氧應(yīng)激的大鼠支氣管上皮頂膜及胞漿中CFTR明顯減少。我們應(yīng)用臭氧攻擊BECs30min，建立氧化應(yīng)激模型。Real-time PCR結(jié)

4、果顯示，臭氧應(yīng)激4h后，CFTR mRNA表達明顯下降。免疫熒光顯示正常BECs胞膜有較強的CFTR染色，臭氧處理后，CFTR在膜及胞漿均明顯下降。Western blot結(jié)果顯示臭氧應(yīng)激4h后，CFTR蛋白明顯下降。全細胞膜片鉗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在沒有激動劑的情況下，記錄的CFTR c1-電流很小，在加入5μM forskolin，記錄出明顯的CFTR c1-電流，在forskolin的基礎(chǔ)上，可觀察到臭氧應(yīng)激4h后的BECs CFTR c1

5、-電流下降。在隨后的試驗中，發(fā)現(xiàn)這種c1-電流能被CFTR c1-電流抑制劑glibenclamide阻滯，而不能被非CFTR c1-電流抑制劑DIDS所阻斷，說明記錄出的c1-電流是CFTR c1-電流。 為了研究氧化應(yīng)激抑制BECs CFTR表達的信號機制，在臭氧應(yīng)激前，BECs被JAK2激酶抑制劑AG490(10μmol/L)預(yù)處理4h，Real-timePCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)臭氧應(yīng)激后，AG490能增加CFTR mRNA的表達，

6、AG490單獨處理對CFTR mRNA的表達沒有影響。免疫熒光和Westem blot結(jié)果均顯示AG490預(yù)處理能增加CFTR蛋白的表達。隨后Western blot結(jié)果顯示在未受臭氧處理的BECs，STAT1蛋白的磷酸化水平很小，在臭氧處理后，STAT1的磷酸化水平隨時間依賴性增加。在前期實驗中我們已發(fā)現(xiàn)臭氧應(yīng)激后，小分子NO、CO、ROS增加。為了了解這些小分子是否參與臭氧誘導(dǎo)的STAT1的磷酸化。應(yīng)用這些小分子抑制劑預(yù)處理BECs

7、，免疫熒光和Western blot結(jié)果顯示AG、ZnPP-9、NAC均降低了臭氧誘導(dǎo)的STAT1的磷酸化。 我們還對信號分子抑制劑是否調(diào)節(jié)臭氧應(yīng)激后CFTR的表達進行了研究。Real-time PCR和Western blot結(jié)果顯示AG，NAC預(yù)處理能增加臭氧應(yīng)激后CFTR的表達，而ZnPP-9則影響不明顯。 2)VIP激活支氣管上皮細胞CFTR轉(zhuǎn)運及通道活性 CFTR轉(zhuǎn)運涉及到四個過程，最終調(diào)節(jié)細胞和膜上

8、CFTR的水平。1) CFTR合成及構(gòu)想成熟后，從ER轉(zhuǎn)運至胞膜表面；2)在細胞膜表面，CFTR通過小泡以及酪氨酸為基礎(chǔ)的基序發(fā)生內(nèi)吞作用，CFTR從胞膜內(nèi)陷至內(nèi)涵體；3)胞吞的CFTR CFTR循環(huán)回胞膜上；4)胞吐的CFTR發(fā)生降解。CFTR只有在胞膜上才能對C1-的跨膜轉(zhuǎn)運，在跨上皮鹽類物質(zhì)轉(zhuǎn)運、水分流動和離子濃度調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。為了解CFTR的轉(zhuǎn)運過程，我們通過以下實驗來觀察。免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)VIP作用以后，循環(huán)回胞膜的CF

9、TR增多，VIP促進了CFTR向胞膜的循環(huán)。免疫共沉淀結(jié)果顯示正常BECs既表達成熟型CFTR(BandC)，又表達非成熟型CFTR(Band B)。臭氧降低了成熟型CFTR的表達，而VIP則增加了成熟型CFTR的表達。Western blot結(jié)果顯示臭氧降低了胞膜和總CFTR的蛋白水平，VIP增加了胞膜和總CFTR的蛋白水平，VIP促進了CFTR向膜的轉(zhuǎn)運。 隨后我們研究VIP對BECs上CFTR依賴的c1-轉(zhuǎn)運的調(diào)控機制進行

10、了研究。采用氯離子敏感熒光染料MQAE檢測胞內(nèi)c1-濃度和氯化物的分泌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VIP具有與forskolin一樣增加胞內(nèi)c1-濃度和氯化物的溢出的特性，并隨濃度升高而增大。全細胞記錄結(jié)果顯示在VIP的作用下，CFTR Cl-電流密度增加，并具有濃度依賴性，在10-8mmol/L為最大半數(shù)有效劑量。CFTR Cl-阻斷劑glibenclamide能阻斷該電流，而非CFTR Cl-阻斷劑不能阻斷該電流。我們應(yīng)用PKA阻斷劑H89，結(jié)果發(fā)現(xiàn)

11、H89部分阻斷了VIP激活的CFTR Cl-電流；應(yīng)用PKC阻斷劑H7(200μM)，同樣結(jié)果發(fā)現(xiàn)H7部分阻斷了VIP激活的CFTR Cl-電流。 在BECs上存在著多種VIP受體(VPAC)，我們應(yīng)用(10-8-10-10M)VIP受體拮抗劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VIP受體拮抗劑能劑量依賴性抑制VIP激活的CFTR Cl-電流。 3) CFTR基因表達調(diào)控研究 為了進一步探討臭氧應(yīng)激后CFTR的基因表達調(diào)控機制，我們對臭氧

12、應(yīng)激條件下CFTR的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)譜進行了研究。實驗首先用TESS軟件對CFTR啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點進行搜索，然后根據(jù)搜索結(jié)果，設(shè)計了6條探針，覆蓋所有的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，應(yīng)用EMSA和ChIP的方法篩選了調(diào)控CFTR表達的轉(zhuǎn)錄因子。結(jié)果顯示探針5、6有探針與蛋白結(jié)合形成的滯后帶，能被100倍未標(biāo)記探針?biāo)偁帲瑸樘禺愋越Y(jié)合。通過突變探針結(jié)合實驗和抗體超遷移實驗，證實這2條探針結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子分別為Sp1、ERa。臭氧應(yīng)激4h后，降低了這

13、兩種轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合活性。ChIP實驗顯示，Sp1和ERa可特異性與CFTR啟動子結(jié)合。 緊接著，我們用基因定點突變技術(shù)觀察了兩種轉(zhuǎn)錄因子對CFTR啟動子活性的影響，結(jié)果顯示Sp1與ERα的結(jié)合位點突變后，CFTR啟動子活性下降，Sp1與ERα結(jié)合位點同時突變，可幾乎到達到臭氧應(yīng)激對CFTR的抑制。隨后，我們用反義寡核苷酸技術(shù)觀察了兩種轉(zhuǎn)錄因子對CFTR表達的影響，Western證實了兩種ASOs的有效性，他們可分別阻斷兩種

14、轉(zhuǎn)錄因子的蛋白表達。應(yīng)用兩種ASOs后，我們用real-time PCR和Western觀察到，Sp1和ERα ASO處理可降低CFTR的表達。 通過進一步的研究，我們用EMSA觀察到ERα與Sp1的結(jié)合活性在0-1h之間激活，于應(yīng)激后2h開始下降。real-time PCR檢測CFTR的表達與臭氧應(yīng)激后ERα和Sp1的轉(zhuǎn)錄活性一致。我們還用免疫熒光觀察到臭氧應(yīng)激4h后，Sp1核轉(zhuǎn)位降低。 臭氧應(yīng)激4h后，Sp1，ERα

15、與CFTR的啟動子區(qū)的結(jié)合活性及核轉(zhuǎn)位降低，抑制CFTR轉(zhuǎn)錄。 綜上所述：本研究觀察到臭氧應(yīng)激抑制了BECs上CFTR的表達及功能，這為本課題提出的非CF疾病的氣道炎性疾病中CFTR的功能下降提供了依據(jù)。研究還觀察到臭氧應(yīng)激后，NO、ROS產(chǎn)生增多，參與并激活了STAT1的磷酸化，抑制了CFTR的表達，臭氧應(yīng)激還使Sp1，ERα與CFTR的啟動子區(qū)的結(jié)合活性及核轉(zhuǎn)位降低，抑制CFTR轉(zhuǎn)錄。另外本研究研究了VIP激活了CFTR的轉(zhuǎn)

16、運及門控特性，PKA和PKC途徑通過調(diào)節(jié)CFTR調(diào)節(jié)區(qū)上的磷酸化位點調(diào)節(jié)了CFTR的通道功能，為治療包括CF疾病在內(nèi)的氣道炎性疾病因CFTR功能下調(diào)引起的黏液粘稠問題提供了選擇。 結(jié)論： 臭氧應(yīng)激抑制了BECs上CFTR的表達及功能。其機制如下： (1)臭氧應(yīng)激抑制了CFTR的表達。其途徑有早期信號分子NO和ROS的產(chǎn)生，進而激活JAK/STAT途徑參與臭氧應(yīng)激抑制CFTR的表達。臭氧應(yīng)激還使轉(zhuǎn)錄因子Sp1，ER