肺炎支原體莢膜多糖結(jié)合DC-SIGN對DC分泌細(xì)胞因子及成熟的影響.pdf

1、目的：證實肺炎支原體（Mycoplasma penumoniae,Mp）的莢膜多糖（capsular polysaccharied,CPS）是樹突狀細(xì)胞（dendritic cell,DC）表面樹突狀細(xì)胞特異性細(xì)胞間黏附分子-3-結(jié)合非整合素分子（dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing nonintegrin,DC-SIGN）的病原相關(guān)分子模式

2、（pathogen-associated molecular patterns, PAMP），了解Mp CPS與DC-SIGN結(jié)合后對DC分泌細(xì)胞因子、吞噬功能及成熟的影響，為研究Mp的免疫逃避機(jī)制提供新的理論依據(jù)。
　　方法：復(fù)蘇和培養(yǎng)Mp M129菌株，離心收集菌體沉淀并抽提純化CPS和脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白（lipid associated membrane proteins,LAMPs），用苯酚-硫酸法和BCA法分別測定CPS和L

3、AMP的濃度。通過密度梯度離心法從健康人新鮮的外周血中分離外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs），并將其誘導(dǎo)成為DC，通過顯微鏡直接觀察、吉姆薩染色觀察及流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry, FCM）鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞是否為DC；通過間接免疫熒光分析（indirect immunofluorescence assay,IFA）檢測Mp CPS和DC-SIGN的相互結(jié)合；收

4、集CPS和/或LAMPs處理的未成熟DC（immature dendritic cell, iDC）培養(yǎng)上清，用酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）檢測CPS和/或LAMPs作用于iDC后，白細(xì)胞介素10（interleukine10, IL-10）和白細(xì)胞介素12（interleukine12, IL-12）的表達(dá)水平。FCM檢測CPS和/或LAMPs刺激前后iDC對FI

5、TC-dextran（多聚糖）的吞噬能力，了解其對DC吞噬功能的影響。同時用FCM檢測CPS和/或LAMPs處理后DC表面HLA-DR抗原、DC特異標(biāo)志CD83以及協(xié)同刺激分子CD80/B7-1、CD86/B7-2的表達(dá)，分析CPS和/或LAMPs對DC成熟的影響。
　　結(jié)果：
　　1.抽提的CPS的濃度為0.751 mg/ml，LAMPs的濃度為0.217 mg/ml。
　　2.顯微鏡直接觀察和吉姆薩染色觀察發(fā)現(xiàn)貼壁

6、的人PBMCs經(jīng)完全培養(yǎng)基培養(yǎng)1～2 d，尚未誘導(dǎo)成iDC，細(xì)胞呈散在狀態(tài)。培養(yǎng)3～5d在細(xì)胞因子的刺激下分化成iDC，部分細(xì)胞呈克隆增殖團(tuán)。在第6 d用脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）刺激后誘導(dǎo)成熟的mDC可出現(xiàn)典型的樹突狀態(tài)，細(xì)胞的體積略有增大；FCM檢測發(fā)現(xiàn)經(jīng)LPS刺激后， HLA-DR表達(dá)由（29.525±8.19）％升高為（77.47±19.11）%，B7類分子 CD80由（48.50±0.59）%升高為

7、（86.85±11.24）%，CD86由（32.71±12.70）%升高為(84.95±1.81)%。3.用IFA分析CPS與DC-SIGN的相互作用，發(fā)現(xiàn)用同源熒光抗體染色后熒光顯微鏡下可見CPS發(fā)綠色熒光，DC-SIGN發(fā)紅色熒光，而細(xì)胞核用DAPI染色后發(fā)藍(lán)色熒光。未處理組DC表面可檢測到紅色的熒光顆粒，用DC-SIGN的特異性中和抗體預(yù)處理后， DC細(xì)胞表面檢測不到紅色熒光，表明抗體可封閉DC-SIGN。CPS作用后的iDC和成

8、熟DC（mature dendritic cell, mDC）表面可同時檢測到綠色和紅色熒光，兩者融合后發(fā)黃色熒光，而且用DC-SIGN封閉抗體處理后，DC細(xì)胞表面檢測不到綠色和紅色熒光。4. CPS和/或LAMPs刺激iDC18h后ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-10和IL-12的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)LAMPs單獨處理組與對照組IL-10表達(dá)水平差異無顯著性（P>0.05）， CPS單獨處理組及其與LAMPs共處理組和對照組細(xì)胞相比，培養(yǎng)

9、上清中的IL-10水平差異有顯著性（P<0.001）；且CPS和LAMPs共處理組iDC分泌IL-10較兩單獨處理組顯著增高（P<0.05），用2.8μg/ml CPS與7.2μg/ml LAMPs共處理時iDC分泌的IL-10的含量最高。而各處理組之間iDC分泌的IL-12無顯著性差異（P>0.05）。
　　5. CPS和/或LAMPs刺激iDC18h后FCM檢測DC對FITC-dextran的吞噬作用，結(jié)果顯示CPS單獨刺激組

10、較未處理組iDC吞噬的FITC-Dextran平均熒光強(qiáng)度顯著增加（P＜0.01）。CPS和LAMPs共刺激組較未處理組iDC吞噬的FITC-Dextran平均熒光強(qiáng)度差異無顯著性（P＞0.05）。
　　6. FCM檢測CPS和/或LAMPs刺激前后DC細(xì)胞表面膜分子CD80、CD86、CD83和HLA-DR的變化，發(fā)現(xiàn)CPS單獨刺激組較未處理組DC細(xì)胞膜表面四種膜分子的表達(dá)顯著下降（P＜0.05），LAMPs單獨刺激組DC較未處

11、理組iDC的四種膜分子顯著性增加（P＜0.001）；CPS和LAMPs共刺激組DC表面的CD80、CD86和HLA-DR膜分子均較未處理組DC和CPS處理組DC顯著性增加（P＜0.001），但與LAMPs單獨處理組差異無顯著性（P＞0.05）；而共刺激組CD83較未處理組和LAMPs處理組顯著下降（P＜0.001），與CPS處理組差異無顯著性（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1. DC-SIGN可識別并結(jié)合Mp CPS；<