喘咳寧方對發(fā)作期哮喘的臨床和實驗研究.pdf

1、目的: 支氣管哮喘(簡稱哮喘)是一種由嗜酸性粒細胞、肥大細胞和淋巴細胞等多種炎癥細胞參與的慢性非特異性氣道炎癥，產(chǎn)生多種炎癥介質及細胞因子，作用于炎性細胞本身及氣道上皮細胞、平滑肌細胞等氣道結構細胞，一方面促進炎癥的發(fā)展，同時也導致氣道重塑，氣道反應性增加，氣道壁增厚，通氣受阻，肺功能下降；并直接或間接導致哮喘氣道內血管生成。氣道重塑和氣道血管生成已經(jīng)成為哮喘重要的病理特征。 哮喘氣道重塑是一個集合性術語，特指哮喘患者氣

2、道壁結構的改變不同于正常氣道組織學改變，在哮喘患者氣道中除有炎性細胞浸潤外主要表現(xiàn)為上皮脫落、氣道平滑肌層的增生和肥大及基底的增厚及其玻璃樣變。1992年哮喘時“呼吸道重塑(airwayremoding)”概念被明確提出。氣道重塑可導致氣流不可逆阻塞和持續(xù)性的氣道高反應性，并能成為頑固性哮喘的病理學基礎，研究它有利于防止哮喘病情的惡化；氣道重塑不僅發(fā)生在哮喘的晚期，而且出現(xiàn)在哮喘的早期，隨著哮喘的發(fā)展，氣道重塑呈進行性加重，即使哮喘癥狀

3、得到緩解，氣道重塑仍呈持續(xù)性發(fā)展，治療哮喘若不從氣道重塑上下手，哮喘的治療就不能從根本上得到緩解。轉化生長因子β1(transforming growthfactor-β1,TGF-β1)在氣道重塑中發(fā)揮了重要作用。 氣道血管生成是指從原有血管長出新生血管，表現(xiàn)為血管數(shù)目增多。血管在氣道固有層中的數(shù)量和所占面積比例增加。即血管密度增加。哮喘氣道的血管變化可引起氣道功能的改變。炎癥反應與血管生成密切相關，作為炎性細胞進入氣道的通路

4、，氣道血管結構和功能的異常也有助于哮喘氣道炎癥反應的持續(xù)，可引起以下病理生理和臨床異常：氣道壁水腫，加重氣道狹窄，增加氣道高反應性，增加炎性細胞的滲出，加重氣道炎癥等; 哮喘發(fā)作時釋放的炎癥介質亦有部分促血管形成的作用，血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)在其中起主要作用。哮喘急性發(fā)作期氣道的平滑肌和小血管痙攣，氣道組織缺氧嚴重，在缺氧的環(huán)境中VEGF顯著增加，促進血管的構建

5、及生長，并誘導血管的擴張。多種炎癥介質的促血管形成作用都是由VEGF的作用介導的。 本課題研究的目的就是通過對發(fā)作期哮喘的臨床和實驗研究觀察氣道重塑及氣道內血管生成的改變，初步探討其機制及意義。研究中藥在抑制氣道血管生成，延緩氣道重塑方面的作用，提高中藥治療哮喘的臨床效果。探討中藥治療哮喘的可能機制，為中醫(yī)藥治療哮喘提供可靠的實驗和臨床依據(jù)一、臨床研究內容與方法方法1．一般資料自2004年12月至2007年3月共治療發(fā)作期哮喘5

6、6例，病例來源于中國中醫(yī)科學院望京醫(yī)院和北京市協(xié)和醫(yī)院及河南中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，為住院或門診病人，見下表病例一般資料將所得數(shù)據(jù)利用Excel軟件進行統(tǒng)計分析。 2．病例選擇標準觀察病例納入標準： (1)符合支氣管哮喘診斷標準和中醫(yī)哮病證類診斷標準者； (2)符合支氣管哮喘嚴重度分級標準之輕、中度者； (3)年齡≥14周歲。 觀察病例排除標準： (1)符合納入標準，但伴有已(或未)明確診斷的

7、、可造成呼吸急促的其他疾??； (2)符合納入條件，但伴有心、肝、腎等一種以上臟器功能不全或(和)腫瘤、血液以及嚴重傳染性疾病，影響療效觀察和安全性判定； (3)符合納入條件，但觀察期間出現(xiàn)停藥或加用與治療哮喘有關的藥物，而影響療效判定； (4)符合納入條件，但對觀察藥物中之任意一成分有過敏史，以及于觀察過程中出現(xiàn)過敏反應且不能排除觀察藥物之因素者。 剔除病例標準： (1)因不良反應終止治療者；

8、 (2)不能按時復診或失訪而無法判斷療效或資料不全者； (3)過敏體質或對本藥物過敏者； (4)治療期間合并各種感染者。 實驗過程中患者滿足上述條件中任一條即可剔除。 3．臨床觀測指標癥狀、體征(1)癥狀(喘息、咳嗽、咯痰)(2)體征(哮鳴音、舌象、脈象)療效性指標(1)療程前后測肺功能(FEV<,1>、PEF)(2)療程前后測血氣分析、嗜酸性粒細胞計數(shù)(EOS)；安全性指標(1)血、尿、便常規(guī)(2)

9、心電圖，肝、腎功能4．統(tǒng)計學處理全部數(shù)據(jù)運用大型統(tǒng)計分析軟件SPSS 11.0進行計算機處理，其中(1)等級資料采用Ridit分析(Ridit analydid)； (2)計數(shù)資料采用卡方檢驗(Chi-squared test)； (3)計量資料采用t檢驗(t-test)。 結論 喘咳寧可通過降低哮喘時外周血中異常升高的EOS數(shù)、降低哮喘患者血清IgE水平、改善肺功能，而減輕氣道炎癥及氣道高反應性，抑制變

10、應性炎癥發(fā)展，緩解或解除支氣管平滑肌痙攣，緩解氣道狹窄，改善通氣功能，達到治療哮喘的目的。 二、實驗研究內容與方法.方法:1．一般資料清潔級BALB/c小鼠60只，雌雄各半，體質量(20.0±2.0)g。 2．模型制備 參照《中藥藥理實驗方法學》實驗性哮喘致敏小鼠模型的建立及有關文獻制備。具體操作步驟： (1)小鼠在清潔級實驗動物房適應性飼養(yǎng)1周后，除A組外，其余各組小鼠均經(jīng)腹腔注射0.01％卵蛋白生理鹽

11、水0.2ml/20g，第7天、14天用同樣的方法再各注射1次； (2)第3次注射后于當天上午并此后每日上午8～10時給予超聲霧化吸入質量分數(shù)為5％的卵蛋白生理鹽水30min以激發(fā)哮喘，每日1次，連續(xù)用14天。激發(fā)時間以目的小鼠出現(xiàn)中度哮喘癥狀為度。 3．動物分組 取6-8周齡雄性BALB/c小鼠60只，體質量(20.0±2.0)g，隨機分為正常對照組(A組)、模型組(B組)、喘咳寧小劑量組(C組)、喘咳寧中劑量組

12、(D組)、喘咳寧大劑量組(E組)、地塞米松組(F組)，每組10只。 4．用藥方法 每次激發(fā)哮喘前1h： A組用生理鹽水代替抗原液進行腹腔注射、霧化吸入和灌胃，用量和時間與其他組完全相同； B組每只小鼠給予生理鹽水，按0.2ml/10g灌胃。 5．標本采集 各組小鼠分別于最后一次激發(fā)后24h脫頸椎處死，眼科剪剖開胸腔，暴露氣管、雙肺；靠近左肺門處結扎左主支氣管。于氣管靠近頭端剪一斜行切口，鈍

13、頭18＃注射器針頭行氣管插管，0.5ml生理鹽水灌洗左肺，回收灌洗液，反復3次，收集BALF1.0-1.2ml，1500r/min室溫下離心5min，取上清液分裝，-20℃保存。取右肺門區(qū)組織(約0.5cm×0.5cm)迅速置入體積分數(shù)為4％的多聚甲醛溶液中固定24h，隨后置入TSJ-IA型自動組織脫水機中處理，60℃石蠟包埋，QPJ-IC生理病理切片機上切取5μm薄片4張，進行免疫組化染色。 6．統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)以x±s標準差表

14、示，方差齊性時，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法：否則采用秩和檢驗，相關分析采用Pearson法。采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行分析。 結論: 哮喘氣道中TGF-β1表達明顯增高，提示TGF-β1過度表達是導致氣道重塑的重要因素，在哮喘氣道炎癥和氣道重塑中發(fā)揮重要作用。 哮喘氣道中VEGF表達明顯增高，提示VEGF可能是哮喘氣道血管生成的主要誘導因子。 喘咳寧方能顯著降低VEGF表達