造血干細(xì)胞轉(zhuǎn)染多藥耐藥基因和體外擴(kuò)增支持大劑量化療的研究.pdf

1、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是目前應(yīng)用最多且最安全的基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，其基因轉(zhuǎn)染效率必須在靶細(xì)胞進(jìn)入分裂周期時才能達(dá)到最高。但是，在正常情況下，絕大多數(shù)造血干細(xì)胞處于靜止期，因而基因轉(zhuǎn)染效率極低。眾多研究者在深入研究造血干細(xì)胞的生物學(xué)特性的基礎(chǔ)上，開發(fā)更為理想的基因載體系統(tǒng)，探索最佳的造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增和轉(zhuǎn)染條件，以便找到一整套臨床可行的高效的造血干細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染方案。在目前的研究中，主要采取以下策略：構(gòu)建新的病毒載體系統(tǒng)(如：采用GALV、VSV-G、R

2、D114等包膜蛋白構(gòu)建的假性病毒載體，腺相關(guān)病毒載體，慢病毒載體，泡沫病毒載體)；應(yīng)用細(xì)胞因子和／或其組合促進(jìn)造血干細(xì)胞進(jìn)入分裂周期；采用基質(zhì)細(xì)胞支持培養(yǎng)的體系模擬骨髓造血微環(huán)境，促進(jìn)造血干細(xì)胞在體外自我更新；采用纖維連接蛋白(flbronectin，F(xiàn)N)定位病毒與造血干細(xì)胞等。用細(xì)胞因子進(jìn)行預(yù)刺激成為造血干細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染的常規(guī)方案。然而，細(xì)胞因子在促進(jìn)造血干細(xì)胞進(jìn)入分裂周期的同時，也易使造血干細(xì)胞發(fā)生分化，損害造血干細(xì)胞長期移植的特性

3、。因此如何在誘導(dǎo)造血干細(xì)胞進(jìn)入分裂周期的同時，又保持其自我更新和多系分化的潛能至關(guān)重要?；|(zhì)細(xì)胞支持培養(yǎng)的體系模擬體內(nèi)的造血微環(huán)境，可以部分性地對抗細(xì)胞因子刺激所誘導(dǎo)的干細(xì)胞分化，使造血干細(xì)胞在體外能夠進(jìn)行自我更新?；|(zhì)細(xì)胞的來源較多，研究者們從臍帶、骨髓和胎肝中分離出多種基質(zhì)細(xì)胞，并將這些基質(zhì)細(xì)胞用SV40轉(zhuǎn)染形成轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，如卵黃囊CD34+內(nèi)皮細(xì)胞、臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系(HUVEC)、MS-5、M2-1084、HESS-5、HES-1

4、、AFT024、2018和2012細(xì)胞系等。這些細(xì)胞系可以單獨(dú)在體外支持造血，但每種細(xì)胞系的支持作用的機(jī)制和效果又不盡相同。其中，胎肝AFT024細(xì)胞系在體外保持造血干細(xì)胞長期移植和多系造血潛能方面，比其它的基質(zhì)細(xì)胞系更具優(yōu)勢。研究發(fā)現(xiàn)AFT024細(xì)胞與造血干細(xì)胞共培養(yǎng)時，可以使臍帶血CD34<'+>CD38<'->細(xì)胞廣泛進(jìn)入細(xì)胞周期，而且更多地進(jìn)行不對稱分裂，這是造血干細(xì)胞在產(chǎn)生子代細(xì)胞的同時保持其自身特性和數(shù)量的特殊分裂方式。因此

5、，我們設(shè)想在造血干細(xì)胞與AFT024細(xì)胞共培養(yǎng)過程中，加入攜帶MDR1基因的病毒上清，可能增加病毒進(jìn)入細(xì)胞核中的概率，從而提高基因轉(zhuǎn)染效率；而且在擴(kuò)增造血干細(xì)胞的同時，還能夠保持其干細(xì)胞的特性，使之能夠成功植入到受體內(nèi)，并長期表達(dá)MDR1基因。本研究首先在AFT024細(xì)胞支持下培養(yǎng)臍帶血CD34<'+>細(xì)胞，并加入病毒上清進(jìn)行MDR1基因轉(zhuǎn)染，在體外檢測基因轉(zhuǎn)染效率及造血干細(xì)胞擴(kuò)增情況；然后將基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞移植到亞致死劑量照射的NOD/

6、SCID小鼠體內(nèi)，研究其是否能夠重建造血，及其能否在紫杉醇化療中起到保護(hù)小鼠骨髓的作用。 第一部分 AFT024細(xì)胞對臍帶血CD34<'+>細(xì)胞多藥耐藥基因轉(zhuǎn)染效率及體外擴(kuò)增的影響目的：采用AFT024細(xì)胞支持的臍帶血CD34<'+>細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)，并進(jìn)行MDR1基因轉(zhuǎn)染的體系，探討AFT024細(xì)胞對造血干細(xì)胞的體外擴(kuò)增及MDR1基因轉(zhuǎn)染效率的作用。 方法：將含有人類MDR1基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pHaMDR1轉(zhuǎn)入包裝細(xì)

7、胞PA317中，秋水仙堿篩選出耐藥克隆后，制備病毒上清。采用免疫磁珠法從臍帶血中分離出CD34<'+>細(xì)胞，在AFT024細(xì)胞滋養(yǎng)層的支持下培養(yǎng)7天后，傳代并繼續(xù)在AFT024細(xì)胞支持下，加入病毒上清進(jìn)行MDRl基因轉(zhuǎn)染培養(yǎng)至21天。以無AFT024細(xì)胞支持的培養(yǎng)體系為對照組。采用RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)MDRlmRNA的表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)檢測P-gP的表達(dá)率；羅丹明-123(rhodamine-123，Rh-123)排出試驗(yàn)檢測P-

8、gP的功能活性；耐藥集落形成試驗(yàn)檢測基因轉(zhuǎn)染效率；分別計(jì)數(shù)有核細(xì)胞總數(shù)(total nucleated cell，TNC)、CD34<'+>細(xì)胞和集落形成細(xì)胞(colony-forming cell，CFC)的擴(kuò)增倍數(shù)來檢AFT024細(xì)胞對造血干/祖細(xì)胞擴(kuò)增的作用。結(jié)果： (1)AFT024組的轉(zhuǎn)染細(xì)胞中通過RT-PCR法檢測到較高的MDRlmRNA水平，其基因轉(zhuǎn)染效率(46.0﹪)明顯高于對照組(15.2﹪)(P<0.01)；AFT0

9、24組P.gp的表達(dá)率為(31.7﹪±10.2﹪)，明顯高于對照組(12.6﹪±3.9﹪)(P<0.01)；Rh-123排出試驗(yàn)顯示，AFT024組具有P-gp功能活性的細(xì)胞占(35.5﹪±11.4﹪)，明顯高于對照組(16.6﹪±3.2﹪)(P<0.01)。 (2)培養(yǎng)至第7天，對照組TNC、CD34<'+>細(xì)胞和CFC的擴(kuò)增倍數(shù)分別是(12.14±2.6)倍、(2.5±1.0)倍和(4.5±1.4)倍，稍高于AFT024組[分別是(

10、8.2±2.4)倍(2.3±1.1)倍和(3.5±1.0)倍1。但是，兩組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。培養(yǎng)至第14天，對照組TNC的擴(kuò)增倍數(shù)為(102.9±26.6)倍，明顯高于AFT024組[(78.9±16.6)倍](P<0.05)，但是，對照組CD34<'+>細(xì)胞和CFC的擴(kuò)增倍數(shù)分別是(6.6±2.8)倍和(6.7±2.1)倍，低于AFT024組[分別是(16.2±7.6)倍和(9.44-4.0)倍]，其中兩組CD3

11、4<'+>細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。培養(yǎng)至第21天，AFT024組TNC、CD34<'+>細(xì)胞和CFC擴(kuò)增倍數(shù)分別是(145.0±26.8)倍、(37.9±13.9)倍和(27.1±13.3)倍，均高于對照組[分別是(132.0±26.7)倍、(9.1±2.3)倍和(7.7±3.6)倍]，其中，兩組的CD34<'+>細(xì)胞和CFC的擴(kuò)增倍數(shù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 結(jié)論：AFT024細(xì)胞能夠明顯提高M(jìn)

12、DRl基因在臍帶血CD34<'+>細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率，而且具有較強(qiáng)的擴(kuò)增造血干/祖細(xì)胞的能力，CD34<'+>細(xì)胞和CFC得到明顯擴(kuò)增。 方法：將體外AFT024細(xì)胞支持培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染了MDRl基因的臍帶血CD34<'+>細(xì)胞(MDR1組)或新鮮分離的臍帶血CD34<'+>細(xì)胞(對照組)移植到經(jīng)亞致死量射線照射的NOD/SCID小鼠體內(nèi)，每周采集外周血檢測血細(xì)胞計(jì)數(shù)。移植28天后，存活小鼠接受紫杉醇(paclitaxel，PAC，12

13、mg/kg/dx5d)或生理鹽水(normalsaline，NS)腹腔注射，其后每周檢測外周血血細(xì)胞計(jì)數(shù)。在化療結(jié)束后21天，處死小鼠，流式細(xì)胞術(shù)檢測骨髓中人源CD45<'+>細(xì)胞即NOD/SCID-再植細(xì)胞(NOD/SCID-repopulating cells，SRC)的比例和Rh-123<'dull>表型的CD45<'+>細(xì)胞即表達(dá)MDR1基因的SRC的比例。 結(jié)果： (1)造血干細(xì)胞移植后，MDR1組小鼠的WBC恢復(fù)速度

14、明顯快于對照組小鼠，至移植第21天，MDR1組小鼠的WBC數(shù)上升至(4.54±0.6)×10<'9>/L，而對照組小鼠的WBC數(shù)僅升至(2.84±0.8)×10<'9>/L，兩組相比，差異具有極顯著性(P<0.01)。但至移植后第28天，MDR1組和對照組小鼠的WBC數(shù)分別上升至(4.44±0.9)×10<'9>/L和(4.74±0.9)×10<'9>/L，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(2)接受紫杉醇腹腔化療后，MDR1-PAC組

15、小鼠的死亡率是10﹪(1/10)，而對照-PAC組小鼠的死亡率是50﹪(5/10)。MDR1-PAC組小鼠WBC降至最低值的時間比對照-PAC組早，MDR1-PAC組小鼠的WBC于化療第7天降至最低值(2.34±1.4)×10<'9>/L，之后WBC開始回升，至第14天，WBC升至(3.14±1.4)×10<'9>/L，而對照-PAC組小鼠的WBC于第14天降至最低值(1.24±0.7)×10<'9>/L。MDR1-PAC組小鼠WBC的

16、最低值明顯高于對照-PAC組(P<0.05)，而且由于前者造血恢復(fù)開始也較早，至第21天MDR1-PAC組小鼠的WBC升至(5.44±1.2)×10<'9>/L，明顯高于對照-PAC組小鼠[(3.84±1.0)×10<'9>/L](P<0.05)。 (3)化療期間僅接受生理鹽水注射的MDR1-NS組和對照-NS組小鼠骨髓中CD45<'+>細(xì)胞的比例分別為(48.8﹪±17.0﹪)和(50.2﹪±12.7﹪)。接受紫杉醇注射的兩組小鼠的C

17、D45<'+>細(xì)胞的比例明顯低于接受生理鹽水注射的兩組小鼠(P<0.01)，其中MDR1-PAC組小鼠的CD45<'+>細(xì)胞比例(31.0﹪±12.5﹪)稍高于對照-PAC組小鼠(21.8﹪±8.5﹪)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(4)MDR1組小鼠紫杉醇化療后Rh-123<'dull>CD45<'+>細(xì)胞的比例是(38.8﹪±12.9﹪)，明顯高于僅接受生理鹽水注射組(18.7﹪±7.5﹪) (P<0.01)。對照組小鼠接受

18、紫杉醇化療后Rh-123<'dull> CD45<'+>細(xì)胞的比例是(4.1﹪±1.8﹪)，而僅接受生理鹽水注射組是(3.8﹪±1.1﹪)，兩組相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論：體外AFT024細(xì)胞支持培養(yǎng)的并轉(zhuǎn)染了MDR1基因的臍帶血CD34<'+>細(xì)胞，能夠在亞致死劑量照射的NOD/SCID小鼠體內(nèi)重建造血，而且造血恢復(fù)的速度快于新鮮分離的臍帶血CD34<'+>細(xì)胞；在紫杉醇化療后，移植的轉(zhuǎn)染MDR1基因的造血干細(xì)胞能夠保護(hù)