原發(fā)性腎小球疾病患者血清和尿液對小鼠足細(xì)胞Synaptopodin和Podocalyxin表達的影響.pdf

1、目的:本實驗擬利用足細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)從細(xì)胞水平研究IgA腎病、微小病變、膜性腎病患者的血清和尿液對小鼠足細(xì)胞Synaptopodin和Podocalyxin表達的影響，并進一步探索足細(xì)胞特異性分子與蛋白尿的關(guān)系，便于明確足細(xì)胞特異性分子與原發(fā)性腎小球疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)關(guān)系，為原發(fā)性腎小球疾病的診斷和治療開辟新的路徑。研究背景:近年來研究發(fā)現(xiàn)，在膜性腎病、微小病變、IgA腎病、糖尿病腎病、狼瘡性腎炎、以及新月體腎炎的發(fā)病或進展中，足細(xì)胞損傷可

2、能是致病關(guān)鍵，而關(guān)鍵之關(guān)鍵有可能是足細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白的表達異常。足細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白表達異常可以直接或間接影響足細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致足細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)消失，功能異常，最終腎小球足細(xì)胞脫落，導(dǎo)致多種腎小球疾病的發(fā)生、發(fā)展。腎小球足細(xì)胞顧名思義即腎小球的一部分，是腎小球的臟層上皮細(xì)胞，是高度分化成熟的上皮細(xì)胞，功能復(fù)雜。由功能與結(jié)構(gòu)各異的細(xì)胞體、主突、足突(FP)三部分構(gòu)成。相鄰的足突間有直徑約為25nm的裂孔，厚度約為4-6nm，構(gòu)成拉鏈

3、狀的裂隙膜(SD)覆蓋在靠近腎小球基底膜外側(cè)(GBM)上，是腎小球濾過屏障的最外層。當(dāng)腎小球濾過屏障的通透性增加時就會有蛋白的漏出。腎小球足細(xì)胞足突可分為三個功能不同的膜性結(jié)構(gòu)即頂膜區(qū)、裂孔隔膜區(qū)(SD)、基底膜區(qū)（與GBM相連）。足突內(nèi)含像podocin、nephrin、actin等足細(xì)胞蛋白構(gòu)成的肌動蛋白骨架。足細(xì)胞骨架蛋白已被證實的功能有:對腎小球血管袢固有空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定;對足細(xì)胞動靜態(tài)結(jié)構(gòu)的維持;對腎小球內(nèi)壓力的抵抗;對血管內(nèi)皮

4、生長因子的分泌及合成;對腎小球內(nèi)皮細(xì)胞功能完整性的維持;及血漿蛋白濾過的電荷、分子屏障的構(gòu)成。另外還包含一些生物活性因子的衍生、細(xì)胞因子的變化、及內(nèi)吞作用。近幾十年發(fā)現(xiàn)的足細(xì)胞表達的特異分子蛋白按區(qū)域可分為:SD蛋白復(fù)合體(Nephrin及其同源物;Podocin;CD2相關(guān)蛋白;TRPC6;經(jīng)典鈣黏素(P-cadherin)、原鈣黏素FAT;緊密連接蛋白ZO-1等）、基底膜區(qū)與GBM相連的蛋白(A3B1整合素;Dystroglycan

5、s)、頂膜區(qū)蛋白（Podocalyxin;腎小球上皮蛋白-1等）、肌動蛋白相關(guān)蛋白（Synaptopodin;A-actinin-4;Ezrin）、腫瘤相關(guān)蛋白(WT1)。足細(xì)胞表達的特異分子蛋白的表達情況直接或間接影響到腎臟疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后。
　　 方法:本實驗所需的原發(fā)性腎小球疾病病例數(shù)為30例（包括IgA腎病10例、微小病變10例、膜性腎病10例）血清和尿液的留取:選取2011年3月至2012年12月確診為原發(fā)性膜性

6、腎病的患者10例，在河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院腎內(nèi)科住院并行腎穿刺活檢臨床和病理證實，其中肝炎篩查陰性、自身抗體陰性、腫瘤標(biāo)記物陰性，未服用激素及免疫抑制劑及腎臟保護藥物包含ACEI或ARB。除外高血壓、糖尿病、遺傳性腎炎。其中10例患者在臨床上表現(xiàn)為24h尿蛋白定量均＞3.5g，血肌酐正常，eGFR＞90ml/min。原發(fā)性IgA腎病患者血清和尿液:取2011年3月至2012年12月10例患者于河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院腎內(nèi)科住院并行腎穿刺活檢臨

7、床和病理確診為原發(fā)性IgA腎病，除外過敏性紫癜、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病、肝硬化等，未用過激素及免疫抑制劑及腎臟保護藥物包含ACEI或ARB，除外高血壓、糖尿病、遺傳性腎炎。臨床上24h尿蛋白定量＞1.0g但是＜2.0g，血肌酐均正常，且eGFR＞90ml/min。原發(fā)性腎小球微小病變:取2011年3月至2012年12月確診為腎小球微小病變在河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院腎內(nèi)科行腎穿刺活檢臨床和病理證實的患者10例，除外重金屬中毒等引起，未用過激素

8、及免疫抑制劑及腎臟保護藥物包括ACEI或ARB或他汀類降脂藥，除外高血壓、糖尿病、遺傳性腎炎。臨床上10例患者24h尿蛋白定量均＞3.5g，血肌酐正常且eGFR＞90ml/min。不同濃度的血清和尿液分別于12、24、48h刺激體外培養(yǎng)的小鼠足細(xì)胞行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。通過病理圖像分析儀檢測Podocalyxin和Synaptopodin指標(biāo)的表達強度。
　　 結(jié)果:免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，在IgA組、微小病變組濃度為5％的血清

9、和10％尿液對Synaptopodin的表達影響是48小時內(nèi)表達強度隨時間的延長而有所增加，對照組無明顯變化;而IgA組、微小病變組濃度為5％血清和10％尿液對Podocalyxin的表達影響則是在48小時內(nèi)隨時間的延長而有所下降，對照組無明顯變化;在膜性腎病組濃度為5％血清和10％尿液對Synaptopodin的表達影響是在48小時內(nèi)于24小時時有短暫升高之后下降，對照組無明顯變化;而在膜性腎病組濃度為5％血清和10％尿液對Podoc

10、alyxin的影響依舊是在48小時內(nèi)隨時間的延長表達逐漸下降，對照組無明顯變化(P＜0.05)。三種不同病理類型患者血清和尿液刺激的小鼠足細(xì)胞檢測Podocalyxin組細(xì)胞形態(tài)變瘦，細(xì)胞數(shù)目變少;而檢測Synaptopodin組細(xì)胞數(shù)目與形態(tài)變化均不大。在不同類型腎臟疾病間相比較Synaptopodin或Podocalyxin的表達無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:通過刺激過后腎小球足細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白Podocaly