卡托普利對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活化與損傷的保護(hù)作用及其在急性肺損傷中治療作用的研究.pdf

1、本文通過體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，觀察細(xì)菌脂多糖誘導(dǎo)HUVEC活化及損傷的狀態(tài)下及在體油酸誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷(ALI)過程中，在血管內(nèi)皮活化及損傷狀態(tài)下，探討卡托普利的保護(hù)作用及其可能的機(jī)制。 研究材料與方法： 一、實(shí)驗(yàn)材料： (一)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)材料： 健康新生兒臍帶25～30cm，由沈陽市鐵西區(qū)婦嬰醫(yī)院提供。 (二)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分： wistar大鼠72只，體重2

2、20～260g，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。 (三)臨床實(shí)驗(yàn)對(duì)象： ICU、RICU內(nèi)危重病患者21例，根據(jù)臨床表現(xiàn)、體征、X線胸片、血?dú)夥治鼋Y(jié)果確診為ALI或ARDS。ICU內(nèi)對(duì)照者10例，健康對(duì)照者15例。 二、實(shí)驗(yàn)步驟： (一) 細(xì)胞培養(yǎng)部分： 1.人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)： 采用改良Jaffe等法。用0.25％的胰蛋白酶灌注消化臍靜脈后，離心收集內(nèi)皮細(xì)胞，接種于75cm<'2?培養(yǎng)

3、瓶，置于37℃、5％CO<,2>飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)培養(yǎng)液為含20％新生牛血清的DMEM。待細(xì)胞長(zhǎng)滿2/3瓶底后進(jìn)行傳代。Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化染色陽性，證實(shí)為內(nèi)皮細(xì)胞。 2.實(shí)驗(yàn)分組： 實(shí)驗(yàn)分為3組：對(duì)照組：常規(guī)無血清DMEM培養(yǎng)；LPS組：1μg/ml LPS；Cap+LPS組：根據(jù)Cap濃度的不同(10<'-7>mol/L、10<'-5>mol/L及10<'-3>mol/L)分為3個(gè)亞組，在每個(gè)亞組中LPS(1μg

4、/ml)和Cap同時(shí)加入。 3.細(xì)胞培養(yǎng)上清血管假性血友病因子(vwF)的測(cè)定： 用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)各組培養(yǎng)上清中vWF的抗原含量(％)?？贵w為兔抗人vWF的單克隆抗體，方法按試劑盒說明書進(jìn)行。 4.間接免疫熒光方法檢測(cè)HUVEC的細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)蛋白表達(dá)： 各組HUVEC以PBS洗滌2次，0.25％胰蛋白酶消化，收集各組細(xì)胞，加入兔抗人ICAM-1多克隆抗體100μl

5、，37℃孵育1h，冷PBS洗滌3次，1000r/min，5min，離心去上清液，加入羊抗兔IgG-FITC 20μl，室溫避光反應(yīng)90min，流式細(xì)胞儀測(cè)定每組細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度(MFI)，以Cell Quest軟件分析細(xì)胞膜表面ICAM-1蛋白表達(dá)。 5.原位雜交方法檢測(cè)HUVEC的腫瘤壞死因子-α(TNFα)mRNA表達(dá)： 按照TNF α mRNA原位雜交試劑盒操作方法進(jìn)行。培養(yǎng)于蓋玻片的各組內(nèi)皮細(xì)胞用4％多聚甲醛室

6、溫固定20min。胃蛋白酶于37℃消化60s。37℃預(yù)雜交液4h，37℃雜交過夜。以2×SSC，0.5×SSC及0.2×SSC洗片，封閉液37℃封閉30min，生物素化鼠抗地高辛37℃孵育1h，SABC孵育20min，DAB顯色20min-30min，蘇木素輕度復(fù)染，封片。陰性對(duì)照用預(yù)雜交液替代探針工作液。鏡下觀察并采用MetaMorth/DP10/BX41型細(xì)胞圖像分析儀進(jìn)行TNFαmRNA的半定量分析。 (二) 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分

7、： 1.分組： 健康雄性wistar大鼠按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為對(duì)照組(C組)、ALI組(0A組)及Cap組(oA+Cap組)。OA組經(jīng)頸靜脈緩慢注射油酸(0.10 ml/kg)；OA+Cap組在注入油酸后立即腹腔注入Cap(1.25 mg/kg)，C組立即腹腔注射等量10％葡萄糖溶液。 2.肺損傷的評(píng)價(jià)： 急性肺損傷通過動(dòng)脈血?dú)夥治?，肺組織學(xué)，肺干/濕比及肺泡灌洗液中細(xì)胞數(shù)量和蛋白含量測(cè)定來評(píng)價(jià)。

8、3.肺組織細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)及核因子(NF)-κB蛋白表達(dá)的測(cè)定： 肺組織石蠟切片ICAM-1及NF-KB免疫組化染色采用鏈親和素-生物素復(fù)合物(SABC)法免疫組化試劑盒檢測(cè)(武漢博士德公司)。ICAM-1陽性反應(yīng)定位于胞漿(呈棕黃色顆粒)：NF-κB核陽性細(xì)胞為胞核呈棕黃色。每張ICAM-1免疫組化切片取5個(gè)不重復(fù)高倍視野，用MetaMorth/DP10/BX41型圖象分析儀測(cè)其吸光度(A)值，取其平均值反映

9、ICAM-1表達(dá)情況。每張NF-KB免疫組化片取5個(gè)不重復(fù)高倍視野，計(jì)算出NF-κB核陽性率(核陽性率=核陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))，以反映活化程度。 4.循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞(circulating endothelial cell，CEC)的分離和計(jì)數(shù)： CEC的檢測(cè)采用Percoll密度梯度離心法。按Mbithe Mutunga法并稍做調(diào)整。每組動(dòng)物觀測(cè)時(shí)間結(jié)束前留取枸櫞酸鈉抗凝靜脈血3mL，加入3mL生理鹽水后輕輕倒置混勻，

10、向試管中加入1.6ml。100％Percoll懸液，室溫下1000r/min，離心10min，取中層液1mL計(jì)數(shù)用。其上清取出到另一試管中，3000r/min，離心20min后棄上清，加入0.5mL生理鹽水，強(qiáng)烈震蕩5min，取上層提取液和中層各1小滴分別加入血細(xì)胞計(jì)數(shù)池內(nèi)，在光鏡下計(jì)數(shù)全部9個(gè)大方格中的CEC數(shù)，以每0.9μL的細(xì)胞數(shù)表示，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)后照相。CEC的鑒定用Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體進(jìn)行免疫組化染色得到證實(shí)。

11、5.血漿纖溶酶原激活物(tPA)及纖溶酶原激活物抑制物(PAI-1)活性的檢測(cè)： 血標(biāo)本的留取同步驟4。tPA及PAI-1活性的檢測(cè)采用發(fā)色底物法測(cè)定，結(jié)果分別以IU/L及AU/L為單位表示。 (三) 臨床實(shí)驗(yàn)部分： 1.標(biāo)本采集： 所有血標(biāo)本均在確診后24 h內(nèi)通過靜脈留置針留取并及時(shí)檢測(cè)。 2.血CEC檢測(cè)： 方法同動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分所用方法，Nikon UFX-Ⅱ型顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)后照相

12、。 3.血漿凝血酶原時(shí)間(prothrombin time，PT)、部分凝血活酶時(shí)間(activated partial thromboplastin time，APTT)、纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)G)、纖維蛋白原降解產(chǎn)物(fibrin degradationproducts，F(xiàn)DP)及D-二聚體的檢測(cè)： PT及APTT測(cè)定采用凝固法；FG測(cè)定采用Clouse法；FDP測(cè)定采用膠乳凝集法；D-二聚體測(cè)定采用E

13、LISA法。 4.血?dú)夥治龅臋z測(cè)： 動(dòng)脈血2mL，美國(guó)AVL-OMNI V型血?dú)夥治鰞x測(cè)定pH值、動(dòng)脈血氧分壓(PaO<,2>)、動(dòng)脈血二氧化碳分壓(PaCO<,2>)。 研究結(jié)果： 1、ELISA及間接免疫熒光法檢測(cè)的結(jié)果提示暴露于1μg/ml LPS后，HUVECs的vWF及ICAM-1表達(dá)明顯強(qiáng)于對(duì)照組，加入Cap后，隨Cap濃度增加明顯下調(diào)LPS升高的HUVECs的vWF及ICAM-1表達(dá)，至Ca

14、p為10<'-3>mol/L時(shí)，其vWF與ICAM-1表達(dá)與LPS組有明顯差別(P<0.05)。Cap抑制LPS升高的HUVECs的vWF及ICAM-1表達(dá)呈一定的濃度依賴方式。 2、原位雜交顯示Cap10<'-5>mol/L及10<'-3>mol/L時(shí)表現(xiàn)明顯下調(diào)HUVECs的TNFαmRNA表達(dá)，與LPS組比較差異明顯(P<0.05，P<0.01)。 3、與對(duì)照組比較，給予油酸2h后各時(shí)相ALI組氧合指數(shù)出現(xiàn)明顯下降

15、，CECs數(shù)量明顯增加；Cap干預(yù)后，各時(shí)相Cap組氧合指數(shù)明顯增加，CECs數(shù)量明顯減少，氧合指數(shù)的變化與CECs數(shù)量的變化明顯負(fù)相關(guān)(R=0.7602，P<0.05=。 4、給予油酸后，OA、OA+Cap兩組的tPA較對(duì)照組明顯下降，而PAI-1明顯升高；Cap干預(yù)后，2h后PAI-1出現(xiàn)明顯下降，4h后tPA出現(xiàn)明顯升高，與對(duì)照組比較差異不明顯(P>0.05)。 5、OA+Cap組肺組織NF-KB核陽性率及ICAM

16、-1表達(dá)顯著高于對(duì)照組，但明顯低于0A組(P<0.05，)。肺組織ICAM-1表達(dá)與NF-KB核陽性率呈明顯正相關(guān)(r=0.7861，P<0.05)。 6、ALI和ARDS組患者CEC數(shù)量明顯高于健康對(duì)照組和ICU內(nèi)對(duì)照組(P<0.05)，且ALⅠ及ARDS組CEC數(shù)量與其APACHE Ⅱ評(píng)分明顯相關(guān)(r=0.55，P<0.05及r=0.62，P<0.05)，與LIS明顯相關(guān)(r=0.60，P<0.05及r=0.53，P<0.0

17、5)；并且CEC數(shù)量與PaO<,2>明顯負(fù)相關(guān)(r=0.49，P<0.05及r=0.64，P<0.05)。 7、ALI和ARDS組患者FDP和D-二聚體較健康對(duì)照組及ICU內(nèi)對(duì)照組明顯增加(P<0.05)，ARDS組患者FG較健康對(duì)照組及ICU內(nèi)對(duì)照組明顯增加(P<0.05)，ALI組患者FG較健康對(duì)照組明顯增加(P<0.05)。 研究結(jié)論： 1、卡托普利對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的HUVEC的活化及損傷有拮抗作用，其機(jī)制可能