妊娠誘導(dǎo)的Treg(piTreg)對(duì)器官移植保護(hù)作用的體外研究.pdf

1、目的：母胎免疫耐受模型——自然界中我們可以借鑒的一個(gè)天然的移植免疫耐受模型.由于正常妊娠與移植耐受機(jī)制有一定的相似性，而小鼠在妊娠期間調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量有明顯的增加，功能也具有一定的特殊性，本實(shí)驗(yàn)通過分離純化孕鼠體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(以下簡(jiǎn)稱piTreg)，在體外刺激高純度piTreg的擴(kuò)增；并驗(yàn)證piTreg擴(kuò)增后表達(dá)上的變化.此外，采用細(xì)胞共培養(yǎng)抑制試驗(yàn)的方法，以期初步評(píng)價(jià)Treg、piTreg和ex-Treg(體外擴(kuò)增后Treg)對(duì)n

2、ave T細(xì)胞增殖抑制率的區(qū)別。
　　 方法：采用清潔級(jí)健康雌性小鼠C57/BL6(H2Kb)，雄性小鼠BALB/c(H2Kd)，體重均為18～23g.將C57/BL6雌性小鼠與BALB/c雄性小鼠同籠受孕。在孕0、7、12、16、20天數(shù)處死母鼠，并取少量非孕鼠做對(duì)照，提取脾臟單個(gè)核細(xì)胞.用流式儀分析孕不同時(shí)間piTreg在單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)情況，確定piTreg(Treg)表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化；以及FoxP3在piTreg中的表

3、達(dá)情況.用流式細(xì)胞分選儀分選piTreg(Treg)，確保純度在90％以上.再將含高濃度的thIL-2和anti-CD3/CD28的擴(kuò)增培養(yǎng)基，刺激分選后的Treg. piTreg. Naive T細(xì)胞和CD4+CD25-T細(xì)胞增殖，比較擴(kuò)增情況；另將nalveT細(xì)胞進(jìn)行CFSE染色，觀察激活后T細(xì)胞增長(zhǎng)規(guī)律。將分選獲得的高純度piTreg、Treg細(xì)胞和ex-Treg作為抑制細(xì)胞，分別與CFSE染色的效應(yīng)細(xì)胞(nalve T細(xì)胞)和刺

4、激細(xì)胞(CD4-T細(xì)胞)進(jìn)行共培養(yǎng)，用ModFit軟件分析效應(yīng)細(xì)胞增殖指數(shù)，以比較各組抑制細(xì)胞的抑制效率。統(tǒng)計(jì)分析用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件完成。
　　 結(jié)果：小鼠Treg占脾臟單個(gè)核細(xì)胞的1～2％，而piTreg占脾臟單個(gè)核細(xì)胞的比例>2％；piTreg中FoxP3約90％呈陽(yáng)性.孕不同時(shí)期piTreg/CD4+T比例分別為：Od:5.27％，7d:7.79％，10d:17.70％，12d:22.99％，18d:16.88％

5、.流式細(xì)胞分選儀分選后，目的細(xì)胞純度可提高至95％以上。將分選獲得Treg、piTreg、nalveT細(xì)胞和CD4+CD25-T細(xì)胞，在含有thIL-2和anti-CD3/CD28的特殊培養(yǎng)基中，相同條件培養(yǎng)，Treg和piTreg每2～3天增加l倍；而NalveT細(xì)胞和CD4+CD25-T細(xì)胞每2天增加2倍。CFSE熒光標(biāo)記nave T細(xì)胞后擴(kuò)增48h，流式分析可見：熒光強(qiáng)度隨著細(xì)胞分裂逐代遞減，通過ModFit軟件分析，效應(yīng)細(xì)胞(n

6、aveT細(xì)胞)與刺激細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)3天后，nalve T細(xì)胞的增殖指數(shù)(PI)達(dá)20；而Treg、ex- Treg(expanded-Treg)及piTreg以1：1培養(yǎng)時(shí)，PI分別為：13.6、15.2、9.6。不同抑制細(xì)胞Treg、Treg/10、piTreg、ex-Treg對(duì)效應(yīng)細(xì)胞的抑制率分別為0.37±07、0.05±.01、0.53±.01、0.24。piTreg的抑制效應(yīng)最強(qiáng)。
　　 結(jié)論：⑴妊娠期小鼠體內(nèi)piTr

7、eg會(huì)得到擴(kuò)增，piTreg/CD4+T的比值隨著孕期呈動(dòng)態(tài)變化，孕中后期較高。⑵流式分選能將Treg(piTreg)純度提高到95％以上，適宜于擴(kuò)增。高濃度的thIL-2和anti-CD3/CD28能對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行有效擴(kuò)增，但piTreg(Treg)的擴(kuò)增效率較低，2倍/周.T細(xì)胞激活后能維持這種活化的狀態(tài)，持續(xù)增殖。⑶nalve T細(xì)胞擴(kuò)增3d后，增殖指數(shù)(PI)可達(dá)20。piTreg與naive T共培養(yǎng)后，PI僅為8.8，有明顯的