microRNA--29對器官移植排斥反應(yīng)的調(diào)控作用及其機(jī)制研究.pdf

1、器官移植作為上世紀(jì)的重大醫(yī)學(xué)突破之一，挽救了數(shù)以萬計(jì)的生命，已經(jīng)成為器官衰竭患者唯一有效的治療手段。隨著上世紀(jì)70年代后免疫抑制劑的出現(xiàn)，細(xì)胞介導(dǎo)的排斥反應(yīng)得到有效控制，移植物的存活期得以顯著延長。但移植排斥反應(yīng)并未完全得到解決，移植排斥導(dǎo)致的移植物失功依然是困擾免疫學(xué)家的難題。
　　移植排斥是機(jī)體免疫系統(tǒng)針對同種移植抗原刺激后多種免疫細(xì)胞和多類型免疫應(yīng)答反應(yīng)的綜合結(jié)果。免疫排斥機(jī)制極其復(fù)雜，不僅涉及移植抗原誘導(dǎo)的獲得性免疫，還涉

2、及缺血再灌注損傷誘發(fā)的先天性免疫;不僅與移植抗原激活的CD4+T、CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫有關(guān)，還與同種特異性抗體介導(dǎo)的體液性免疫應(yīng)答密不可分。此外，在移植排斥反應(yīng)的過程中，不同類型的免疫反應(yīng)同時(shí)或者前后發(fā)生，相互交織。因此，雖然免疫學(xué)的快速發(fā)展為認(rèn)識移植排斥產(chǎn)生的機(jī)制提供了基礎(chǔ)，但目前對于移植排斥的發(fā)生機(jī)制、耐受機(jī)制以及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識仍較為有限。
　　近年來，大量microRNA的研究表明其在免疫細(xì)胞發(fā)育、免疫應(yīng)答以及免疫耐

3、受等免疫學(xué)方方面面均起到了關(guān)鍵性調(diào)控作用。但microRNA與移植免疫的研究依然為數(shù)不多，且絕大部分研究是將microRNA作為移植排斥的診斷指標(biāo)。實(shí)體器官移植的基礎(chǔ)研究僅涉及miR-155、miR-17-92等少數(shù)幾個(gè)microRNA。因此，進(jìn)一步研究microRNA調(diào)控移植排斥的機(jī)制有助于豐富對于移植排斥發(fā)生機(jī)制、耐受機(jī)制以及免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識。
　　前期，本研究所其它人員研究發(fā)現(xiàn):miR-29能夠直接靶向干擾素γ。低表達(dá)mi

4、R-29的轉(zhuǎn)基因小鼠血清中高表達(dá)干擾素γ，能有效抵抗李斯特菌感染。然而，組進(jìn)行同種異基因移植時(shí)卻驚奇發(fā)現(xiàn):低表達(dá)miR-29的轉(zhuǎn)基因小鼠的移植物生存時(shí)間顯著延長至2周以上。IFN-γ作為Th1細(xì)胞（細(xì)胞介導(dǎo)的排斥反應(yīng)最主要的效應(yīng)細(xì)胞）的主要效應(yīng)因子，高表達(dá)IFN-γ往往視作Th1反應(yīng)性增強(qiáng)，移植排斥反應(yīng)理應(yīng)增強(qiáng)。但為何低表達(dá)miR-29后卻能夠顯著延長移植物存活期？miR-29又是通過什么機(jī)制在移植排斥中發(fā)揮如此顯著的作用？是否miR-

5、29其它的靶基因在移植排斥中起到了關(guān)鍵作用？基于這些問題，對miR-29調(diào)控移植排斥的機(jī)制進(jìn)行了研究。
　　第一部分:低表達(dá)miR-29顯著抑制同種異基因移植排斥反應(yīng)。
　　首先，運(yùn)用sponge技術(shù)構(gòu)建了低表達(dá)miR-29的轉(zhuǎn)基因小鼠GS29。選用GS29小鼠作為受體，BALB/c小鼠作為供體，采用改良的Cuff技術(shù)進(jìn)行小鼠頸部異位心臟移植，觀察低表達(dá)miR-29對移植排斥的影響。發(fā)現(xiàn)與對照組相比，GS29小鼠組移植物存活

6、時(shí)間顯著延長，同時(shí)移植心臟、外周免疫器官腫脹程度以及血栓情況顯著輕于對照組。此外，對移植第5天的受體小鼠運(yùn)用流式檢測細(xì)胞亞群發(fā)現(xiàn):與對照組相比，GS29小鼠組引流淋巴結(jié)和脾臟中B細(xì)胞比例明顯減少，T細(xì)胞(CD3+)比例上升。進(jìn)一步檢測T細(xì)胞亞群發(fā)現(xiàn):與對照組相比，GS29小鼠組引流淋巴結(jié)和脾臟中CD8+T細(xì)胞比例上升，CD4+T比例明顯減少。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，與T細(xì)胞相比，B細(xì)胞無論是比例和數(shù)量的減少均更為顯著。進(jìn)一步，對受體小鼠脾臟中Th1細(xì)

7、胞以及受體小鼠脾臟和淋巴結(jié)中的Treg細(xì)胞進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn):兩組小鼠外周免疫器官中的Treg細(xì)胞和Th1細(xì)胞無明顯差異。HE染色發(fā)現(xiàn):GS29小鼠組移植物中免疫細(xì)胞浸潤明顯減少。進(jìn)一步組化實(shí)驗(yàn)證實(shí):與對照組相比，GS29小鼠組移植物中CD4+、CD8+以及CD138+的表達(dá)顯著減少。綜上結(jié)果，提示低表達(dá)miR-29顯著抑制同種異基因移植排斥反應(yīng)的作用可能主要與其同時(shí)抑制細(xì)胞介導(dǎo)的排斥和抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)有關(guān)。同時(shí)我們的結(jié)果顯示，低表達(dá)miR

8、-29可能對抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)的影響更為明顯。
　　第二部分:miR-29影響B(tài)細(xì)胞AICD調(diào)控體液免疫
　　此部分，首先檢測了靜息情況下GS29小鼠體內(nèi)各B細(xì)胞亞群情況。首先發(fā)現(xiàn)GS29小鼠pro-B到PreB、immature B cell到mature B cell生長發(fā)育受阻。GS29小鼠腹腔中B1細(xì)胞亞群無明顯變化，而脾臟中濾泡B細(xì)胞(Fo-B)亞群比例明顯減少。
　　進(jìn)一步，運(yùn)用經(jīng)典的NP偶聯(lián)抗原免疫的方法

9、，腹腔注射TI抗原NP-LPS以及TD抗原NP-KLH，分別研究了GS29小鼠TI和TD免疫應(yīng)答情況，結(jié)果顯示GS29小鼠TD反應(yīng)弱于對照組，而TI反應(yīng)無明顯差異。進(jìn)一步，參照以往的文獻(xiàn)報(bào)道，檢測了GS29小鼠生成DSA的能力，發(fā)現(xiàn)其亦低于對照組。
　　同種抗原被B細(xì)胞識別后，需要在Tfh細(xì)胞的輔助下在外周免疫器官中生成生發(fā)中心，經(jīng)歷體細(xì)胞超頻突變、免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)化，親和力得以成熟，最終分化、增殖為特異性的漿細(xì)胞。流式檢測了同種

10、異基因移植2周后GS29脾臟中生發(fā)中心B細(xì)胞以及Tfh細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)同種異基因移植以后，GS29脾臟中生發(fā)中心B細(xì)胞明顯減少，但Tfh細(xì)胞并無明顯差異。同時(shí)，組化結(jié)果顯示抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)(AMR)的兩個(gè)特異性指標(biāo)（IgG和C4d）在GS29組小鼠移植物中表達(dá)均下調(diào)，提示GS29組小鼠組AMR明顯輕于對照組。這些實(shí)驗(yàn)證實(shí):同種異基因移植情況下，GS29小鼠是由于B細(xì)胞生發(fā)中心形成減少而發(fā)揮抗AMR的作用。
　　為了研究同種異基因移植情

11、況下GS29小鼠B細(xì)胞生發(fā)中心減少的機(jī)制，首先檢測了兩組小鼠脾臟B細(xì)胞活化和增殖的情況，發(fā)現(xiàn)LPS刺激后兩組小鼠脾臟B細(xì)胞增殖能力并無明顯差異，同時(shí)CD86和MHCⅡ的表達(dá)亦無明顯差異。而后，進(jìn)一步檢測了B細(xì)胞活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(Activation Induced Cell Death，AICD)。分選了GS29小鼠脾臟中CD43-B細(xì)胞，體外以anti-IgM刺激10小時(shí)，流式檢測B細(xì)胞的AICD情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GS29小鼠B細(xì)

12、胞AICD明顯強(qiáng)于對照組。這與同種異基因移植后移植物tunel組化染色結(jié)果相一致。從而，認(rèn)為低表達(dá)miR-29影響B(tài)細(xì)胞生發(fā)中心形成可能是B細(xì)胞AICD增強(qiáng)的結(jié)果。
　　第三部分:miR-29直接靶向PTEN影響PI3K/AKT通路調(diào)控B細(xì)胞AICD
　　前面的實(shí)驗(yàn)，在轉(zhuǎn)基因小鼠GS29來源的naive B細(xì)胞上證實(shí)了低表達(dá)miR-29能夠促進(jìn)B細(xì)胞的AICD。但原代B細(xì)胞體外難于存活，后續(xù)實(shí)驗(yàn)難于展開。故而先選用了公認(rèn)的B

13、細(xì)胞AICD體外模型，即體外以羊抗鼠anti-IgM刺激WEHI-231細(xì)胞誘導(dǎo)AICD。轉(zhuǎn)染microRNA-29a/b/c的mimics后WEHI-231細(xì)胞的AICD明顯降低，而轉(zhuǎn)染inhibitor后WEHI-231細(xì)胞的AICD明顯增強(qiáng)。這些實(shí)驗(yàn)再次證明了miR-29能夠有效調(diào)控B細(xì)胞的AICD。
　　進(jìn)一步，對targetscan網(wǎng)站提供的miR-29的1000多個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析，發(fā)現(xiàn)這些靶點(diǎn)中有85個(gè)靶點(diǎn)涉及細(xì)胞存

14、活與生長發(fā)育。再對這85個(gè)基因，進(jìn)行kegg pathway富集分析，選取選取couts比較高的四個(gè)pathway進(jìn)行vanny分析，篩選出兩個(gè)具有廣泛作用的兩個(gè)分子:PTEN與PIK3CA。而后，構(gòu)建了PTEN、PIK3CA以及它們突變體的報(bào)告基因用于雙熒光報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，驗(yàn)證靶點(diǎn)。結(jié)果顯示，miR-29能夠直接靶向PTEN，抑制PTEN3'UTR報(bào)告基因的活性。而對于PIK3CA的靶點(diǎn)驗(yàn)證未能得到證實(shí)。后續(xù)構(gòu)建了PTEN的質(zhì)粒和siR

15、NA，分別進(jìn)行過表達(dá)和干擾實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證miR-29可通過PTEN調(diào)控WEHI-231細(xì)胞的AICD。PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)基因一方面是個(gè)明星抑癌基因，另一方面其帶有雙重特異性磷酸酶，能夠使PIP3（phosphatidylinositol-3，4，5-triphosphate，PIP3）脫磷酸化，最終抑制PI3K/AKT通路。而B細(xì)

16、胞的AICD主要涉及三種信號，PLCγ，Ras和PI3K/AKT。故而，western蛋白印跡法檢測了antagomir-29a-3p處理的WEHI-231細(xì)胞中p-AKT水平，發(fā)現(xiàn)p-AKT水平明顯低于對照組。這一實(shí)驗(yàn)證實(shí)mir-29通過靶向PTEN影響PI3K/AKT通路。進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)p-BAD水平明顯降低，抗凋亡分子Bcl-2和Bcl-xl水平亦降低。以上結(jié)果顯示，mir-29通過靶向PTEN抑制PI3K/AKT信號通路，導(dǎo)致

17、AKT磷酸化水平降低，影響下游抗凋亡分子Bcl-2和Bcl-xl的表達(dá)，最終增強(qiáng)B細(xì)胞的AICD。
　　第四部分:核酸藥物antagomiR-29可作為藥物干預(yù)治療異基因急性移植排斥反應(yīng)。
　　antagomiR-29是膽固醇修飾的miR-29體內(nèi)抑制劑，能夠特異性抑制體內(nèi)miR-29的表達(dá)，往往能夠作為一種核酸藥物來干預(yù)各種疾病模型。為了明確antagomiR-29能否作為作為藥物干預(yù)治療同種排斥反應(yīng)，交由廣州銳博生物科技

18、有限公司合成了antagomiR-29a-3p，尾靜脈注射的方式干預(yù)同種移植排斥反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，同種異基因移植后注射antagomiR-29a-3p可顯著降低同種異基因急性排斥反應(yīng)，移植物生存時(shí)間明顯長于對照組。
　　綜上所述，miR-29能夠直接靶向PTEN基因，通過PI3K/AKT信號通路調(diào)控B細(xì)胞AICD，導(dǎo)致機(jī)體受到同種抗原刺激后外周免疫器官中B細(xì)胞生發(fā)中心生成不足，影響特異性漿細(xì)胞以及DSA的產(chǎn)生，最終抑制抗體介導(dǎo)的