慢性乙型肝炎患者DC表面HLA-Ⅱ分子表達模式及其效應(yīng)研究.pdf

1、慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染已經(jīng)成為一個全球性的公共衛(wèi)生問題,嚴重威脅人類健康。無癥狀攜帶(Asymptomatic carrier)、慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B, CHB)、重型乙型肝炎、肝硬化(Liver cirrhosis, LC)以及肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma)為其不同的臨床疾病表型。研究表明,免疫應(yīng)答是慢性HBV感染致病機制的核心

2、問題,免疫清除后患者痊愈,而持續(xù)的免疫損傷則可導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化、肝癌等不同疾病表型。其中,HBV特異性CD4+T細胞是免疫損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié),其不同細胞亞群的平衡偏向決定了乙型肝炎患者是否發(fā)生免疫損傷,導(dǎo)致了不同的臨床轉(zhuǎn)歸。
　　人類白細胞抗原(Human leukocyte antigen, HLA)復(fù)合體是與疾病相關(guān)聯(lián)的一個重要遺傳因素。目前許多全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome-wide association study, G

3、WAS),在基于大樣本患者人群的基礎(chǔ)上,發(fā)現(xiàn)了HLA-Ⅱ分子基因位點的遺傳變異對HBV的感染、清除、肝癌發(fā)生發(fā)展、疫苗應(yīng)答等臨床轉(zhuǎn)歸起著重要作用,從遺傳流行病學(xué)等角度證實了HLA-Ⅱ分子在HBV保護性免疫中的重要作用[2-4]。HLA-Ⅱ分子正常表達于抗原提呈細胞(Antigen-presenting cell, APC),能夠提呈抗原進而激活CD4+T細胞(Th1、Th2、Th17、Treg、Tfh等)應(yīng)答,啟動機體適應(yīng)性免疫(ada

4、ptive immunity)[1],在T細胞的識別和表位肽識別過程中具有重要作用,一定程度上影響了 CD4+T細胞應(yīng)答的亞群偏向。作為遺傳上共顯性的HLA-DR、DQ、DP分子,在乙型肝炎遺傳易感性中表現(xiàn)出不同的效應(yīng),其關(guān)聯(lián)的具體機制尚不清楚。我們對慢性 HBV感染患者DC表面的 HLA-DR/DQ/DP分子表達表達的組合模式進行觀察,并初步觀察了HLA-DR/DQ/DP抗原提呈對病毒特異性CD4+T細胞的應(yīng)答及極化類型獨立效應(yīng)。

5、r>　　我們首先分離了10例慢性乙型肝炎輕中度(mild and moderate chronic hepatitis B, MCHB)患者和5例健康對照(Healthy control, HC)的外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC),在利用GM-CSF和IL-4體外誘導(dǎo)DC并刺激成熟后,采用多色流式細胞技術(shù),觀察成熟髓樣樹突狀細胞(myeloid dendritic ce

6、ll, mDC)表面HLA-Ⅱ分子表達的組合模式。接著我們同時對mDC和漿樣樹突狀細胞(plasmacytoid dendritic cell, pDC)進行直接觀察,通過分離來自26例慢性乙型肝炎輕中度(mild and moderate chronic hepatitis B, MCHB)、21例慢性乙型肝炎重度(severe chronic hepatitis B, SCHB)以及18例重型乙型肝炎(Acute on chroni

7、c liver failure, ACLF)患者、21例慢性乙型肝炎無癥狀攜帶者(Asymptomatic HBV carriers, AsC)及17例健康對照(Healthy control, HC)的PBMC,采用7色流式細胞技術(shù)同時檢測CHB患者外周血mDC及pDC占PBMC的比例,以及兩種DC亞群細胞表面HLA-Ⅱ分子的表達的組合模式。同時,對4例SCHB和1例MCHB患者mDC和pDC表面HLA-DR/DQ/DP表達模式分別進

8、行了三個不同時相點的連續(xù)觀察。
　　為了評估HLA-DR、DQ、DP抗原提呈對HBV特異性CD4+T細胞極化的獨立效應(yīng),我們分離了20例慢性乙型肝炎輕中度患者的PBMC,分別阻斷HLA-DR/DQ/DP后,采用HBcAg刺激-T細胞體外擴增和HBcAg表位肽刺激-ex vivo直接檢測兩種方案,采用胞內(nèi)細胞因子染色流式細胞術(shù)觀察 CD4+T細胞極化效應(yīng)。并結(jié)合患者臨床指標(biāo)進行綜合分析,試圖得到對慢性HBV感染患者HLA-Ⅱ分子的表

9、達組合模式及其對T細胞極化效應(yīng)的影響和臨床表型之間關(guān)聯(lián)的初步認識。
　　我們的主要研究結(jié)果如下:
　　1.慢性乙型肝炎患者外周血 mDC及 pDC的比例存在不同程度的下降,且與病情嚴重程度相關(guān)。對慢性乙型肝炎重度患者三個不同時相點的連續(xù)觀察結(jié)果提示,隨著患者病情嚴重程度的減輕,其外周血mDC和pDC的數(shù)量和比例有升高。
　　2.健康對照和慢性乙型肝炎患者體內(nèi)直接觀察的 mDC表面的 HLA-II類分子的主要表達模式為四

10、種,即 DR+DQ+DP+、DR+DQ+DP-、DR+DQ-DP-和 DR-DQ-DP-組合模式。mDC表面表達 DR+DQ+DP+的細胞比例在 HC(0.9-39.2)、AsC(0-20.1)、MCHB(1.3-80.7)、SCHB(0.1-90.6)和ACLF(5.2-98.0)組的中位數(shù)分別為17.2、5.9、23.3、40.5和37.3,隨疾病嚴重性的增加而顯著升高(p<0.001)。與pDC相比而言,CHB患者和健康對照mDC

11、表面表達DR+DQ+DP+細胞比例高,而DR-DQ-DP-細胞比例低。
　　3.健康對照和慢性乙型肝炎患者pDC表面HLA-II類分子的主要表達模式除了與mDC相同的四種(即DR+DQ+DP+、DR+DQ+DP-、DR+DQ-DP-和DR-DQ-DP-)組合模式之外,在MCHB組、SCHB組和ACLF組還增加了DR-DQ-DP+模式。pDC表面表達 DR+DQ+DP+的細胞比例在 HC(0.3-21.7)、AsC(0.1-15.2

12、)、MCHB(0.9-57.6)、SCHB(1.2-52.1)和ACLF(0.2-63.6)組的中位數(shù)分別為5.2、1.9、7.3、20.3和15.8,隨疾病嚴重性的增加而顯著升高(p<0.001)。pDC表面表達 DR+DQ+DP-的細胞比例在HC(4.8-76.5)、AsC(0-42.6)、MCHB(1.3-54.1)、SCHB(0.9-71.4)和ACLF(0.2-38.6)組的中位數(shù)分別為32.2、18.7、8.9、11.6和3

13、.2,隨疾病嚴重程度的增加而顯著降低(p<0.05)。同時,pDC表面表達 DR-DQ-DP+的細胞比例在 HC(0.01-5.8)、AsC(0-0.64)、MCHB(0-54.1,1.94)、SCHB(0-13.4)和ACLF(0-56)組的中位數(shù)分別為0.07、0.01、1.9、2.1和3.9,隨疾病嚴重程度的增加而顯著增加(p<0.05)。5個慢性乙型肝炎患者不同時相點的連續(xù)觀察結(jié)果提示類似的變化趨勢。pDC表面表達 DR+DQ-

14、DP-的細胞比例在 HC(0-40.7)、AsC(2.2-32.2)、MCHB(0.2-15.6)、SCHB(0.6-32.0)、ACLF(0-6.36)組的中位數(shù)分別為23.9、12.2、1.9、4.4、0.39,隨疾病嚴重程度的增加而顯著降低(p<0.05)。
　　4.初步的功能實驗顯示,輕中度慢性乙型肝炎患者體內(nèi)存在著一定程度的抗原特異性CD4+T細胞應(yīng)答。在分別阻斷HLA-DR/DQ/DP分子后,引發(fā)的HBcAg特異性CD

15、4+T細胞極化應(yīng)答存在差異。阻斷 HLA-DR或 HLA-DQ后 IFN-γ+ CD4 T細胞(HLA-DR,1.13-18.1 vs0.02-1.26,中位數(shù)分別為10.5 vs0.29,p=0.004; HLA-DQ,0.37-19.6 vs0.02-1.26,中位數(shù)分別為10.79 vs0.29,p=0.002)、IL-17+CD4 T細胞比例(HLA-DR,0.03-0.55 vs0.02-0.16,中位數(shù)分別為0.26 vs0

16、.07,p=0.03;HLA-DQ,0-0.57 vs0.02-0.16,中位數(shù)分別為0.19 vs0.07,p=0.085)均顯著增加,而阻斷HLA-DP后, IFN-γ+(0.34±0.39 vs0.08±0.05,p=0.042)和 IL-17+ CD4 T細胞比例(0.17±0.14 vs0.01±0.01,p=0.012)顯著降低,同時IL-4+CD4 T細胞比例比阻斷HLA-DR(0.1-7.29 vs0.01-3.78,中

17、位數(shù)分別為0.75 vs0.16,p=0.044)后顯著升高。
　　總之,我們通過7色流式細胞技術(shù)對不同臨床表型的慢性乙型肝炎患者和健康對照外周血DC表面的HLA-Ⅱ分子進行了檢測分析,結(jié)果表明HLA-DR/DQ/DP在mDC和pDC表面并不是同等表達,mDC表面有四種主要的組合模式,CHB患者pDC表面還增加了DR-DQ-DP+模式。隨著疾病嚴重程度的加重,慢性乙型肝炎患者mDC表面表達 DR+DQ+DP+的細胞比例顯著升高,p

18、DC表面表達 DR+DQ+DP+、DR-DQ-DP+的細胞比例顯著升高,同時DR+DQ+DP-、DR+DQ-DP-細胞比例顯著降低。在此基礎(chǔ)上,我們進行了初步的功能實驗,對 HLA-Ⅱ分子不同等位效應(yīng)進行了觀察和研究,在分別阻斷HLA-DR/DQ/DP后觀察其后續(xù)激活病毒特異性CD4+T細胞的極化效應(yīng),結(jié)果提示HLA-DR/DQ和HLA-DP所引發(fā)的CD4+T細胞應(yīng)答并不一致,HLA-DR/DQ提呈HBcAg后偏向活化IL-4+CD4