慢性乙型肝炎患者外周血中髓源性抑制細(xì)胞的表達(dá)及其意義.pdf

1、目的：
　　慢性乙型肝炎（CHB）是引起肝硬化、肝衰竭及肝癌的重要原因，嚴(yán)重威脅患者的生存質(zhì)量，充分了解CHB的發(fā)病機(jī)制、分析影響疾病發(fā)生的相關(guān)因素，對(duì)于指導(dǎo)臨床治療具有重要意義。研究表明，HBV持續(xù)感染與T淋巴細(xì)胞耗竭相關(guān)，各種抑制性細(xì)胞、受體和細(xì)胞因子組成的免疫調(diào)控微環(huán)境在其中發(fā)揮著重要作用。髓源性抑制細(xì)胞（MDSCs）是一群髓系來源的異質(zhì)細(xì)胞，可通過多種機(jī)制發(fā)揮免疫抑制功能，但其在CHB發(fā)生發(fā)展中的作用尚不十分清楚。因此本課

2、題將觀察CHB患者外周血中MDSCs及Treg、Th1、Tc1細(xì)胞的頻數(shù)變化規(guī)律，分析MDSCs的表達(dá)與其他免疫細(xì)胞以及患者臨床指標(biāo)間的相關(guān)關(guān)系，并檢測(cè)IL-10、TGF-β及IFN-γ的表達(dá)水平，探討MDSCs在CHB發(fā)病過程中的臨床意義，以期為CHB的臨床免疫治療提供新的思路與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　收集2015年12月-2016年12月于石家莊市第五醫(yī)院就診的CHB患者39例作為病例組，其診斷均符合《慢性乙型肝炎防

3、治指南（2015年版）》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)；并選取同期于石家莊市第五醫(yī)院進(jìn)行體檢的健康體檢者26例作為對(duì)照組，病例組與對(duì)照組間年齡、性別均具有可比性。收集所有研究對(duì)象的基本資料，并采集其外周靜脈血，檢測(cè)肝功能、血清HBV DNA水平等臨床指標(biāo)，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD33+CD11b+HLA-DR-MDSCs的比例，進(jìn)而根據(jù)其CD14與CD15的表達(dá)情況，以CD14+CD15-的MDSCs細(xì)胞作為單核細(xì)胞型MDSCs（M-MDSCs），以CD1

4、4-CD15+的MDSCs細(xì)胞作為粒細(xì)胞型MDSCs（G-MDSCs），觀察兩種亞型所占百分比。以密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其外周血中Treg、Th1、Tc1細(xì)胞頻數(shù)，以CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞為Treg細(xì)胞、CD4+IFN-γ+細(xì)胞為Th1細(xì)胞、CD8+IFN-γ+細(xì)胞為Tc1細(xì)胞，分別計(jì)算其在CD4+或CD8+T細(xì)胞中所占比例。采用ELISA法檢測(cè)血漿中IL-10、TGF-β及IFN-γ的表達(dá)水

5、平。應(yīng)用SPSS21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，比較病例組與對(duì)照組外周血MDSCs及其亞型、Treg、Th1、Tc1細(xì)胞及IL-10、TGF-β等細(xì)胞因子的表達(dá)有無差異；采用Pearson線性相關(guān)分析病例組中MDSCs及其亞型與Treg、Th1、Tc1細(xì)胞的水平是否相關(guān)，以及外周血MDSCs及其亞型與臨床指標(biāo)的相關(guān)關(guān)系。采用多元回歸模型分析CHB患者中MDSCs的主要相關(guān)因素。雙側(cè)P≤0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　

6、　1.CHB患者外周血MDSCs的比例明顯高于健康對(duì)照者（1.19％vs0.33%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-4.071，P<0.001）；與對(duì)照組相比，CHB患者M(jìn)DSCs中G-MDSCs所占比例升高（Z=-2.015， P=0.044），而M-MDSCs無明顯變化（Z=-1.614，P=0.107）。
　　2.CHB患者外周血Treg細(xì)胞比例（3.28%）明顯高于健康對(duì)照者（1.33%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-3.065，P

7、=0.002）；病例組中Th1、Tc1細(xì)胞的比例也稍高于對(duì)照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　3.根據(jù)CHB患者是否接受抗病毒治療，進(jìn)一步將病例組分為初治組與經(jīng)治組，初治組與經(jīng)治組的MDSCs、Treg細(xì)胞頻數(shù)均明顯高于對(duì)照組（MDSCs：初治組vs經(jīng)治組vs對(duì)照組：1.20%vs1.20%vs0.33%， H=16.70，P<0.001；Treg細(xì)胞：初治組vs經(jīng)治組vs對(duì)照組：3.24%vs3.28%vs1.33%

8、，H=9.985，P=0.007），但初治組與經(jīng)治組間MDSCs、Treg細(xì)胞的分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；三組間MDSCs中兩種亞型所占百分比及Th1、Tc1細(xì)胞頻數(shù)分布，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　4.初治 CHB患者外周血中 MDSCs水平與 Th1細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)（r=-0.645，P=0.013），但與Treg或Tc1細(xì)胞不具有相關(guān)性（P>0.05）；MDSCs的兩種亞型：G-MDSCs、M-MDSCs與

9、Treg、Th1、Tc1細(xì)胞均不相關(guān)（P>0.05）。
　　5.初治CHB患者外周血MDSCs的百分比與ALT及HBV-DNA水平呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r分別為0.436與0.542，但與AST、TBIL、DBIL水平無相關(guān)關(guān)系（P>0.05）。MDSCs的兩種亞型，G-MDSCs、M-MDSCs與ALT、AST、TBIL、DBIL及HBV-DNA水平均不相關(guān)（P>0.05）；比較HBeAg（+）與HBeAg（-）組間MDSCs及其亞

10、型的頻數(shù)，發(fā)現(xiàn)HBeAg（+）的CHB初治患者中MDSCs比例[(1.36±0.79)%]高于HBeAg（-）組[(0.82±0.59)%]，G-MDSCs與M-MDSCs所占百分比略高于HBeAg（-）組，然而差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　6.與健康對(duì)照者相比，CHB患者外周血中IL-10的水平明顯升高[病例組vs對(duì)照組：（7.00 vs5.43）pg/mL]，而TGF-β1[病例組vs對(duì)照組：（185.6 vs29

11、8.67）pg/mL]與IFN-γ[病例組vs對(duì)照組：（31.84 vs47.16） pg/mL]的水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　7.CHB患者外周血中IL-10、TGF-β1、IFN-γ的表達(dá)水平與MDSCs及其兩種亞型的頻數(shù)間均無相關(guān)關(guān)系（P>0.05）。
　　8.CHB患者外周血中IL-10的表達(dá)與ALT、AST、TBIL、DBIL及HBV-DNA水平均呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r分別為0.487、0

12、.757、0.487、0.486、0.664；然而，TGF-β1及IFN-γ與ALT、AST、TBIL、DBIL及HBV-DNA水平均無相關(guān)關(guān)系（P>0.05）。
　　9.多元線性回歸模型結(jié)果顯示，在初治CHB患者中，HBV-DNA與Th1細(xì)胞水平為影響MDSCs表達(dá)的主要相關(guān)因素（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.與健康對(duì)照者相比，CHB患者外周血中MDSCs比例明顯升高，其中G-MDSCs所占比例升高，而M-M

13、DSCs無明顯變化，Treg細(xì)胞所占百分比也明顯升高，而Th1、Tc1細(xì)胞的頻數(shù)在兩組間無明顯差異，提示MDSCs與Treg細(xì)胞可能共同參與CHB患者的免疫耐受過程，HBV持續(xù)感染可導(dǎo)致免疫抑制性成分水平上調(diào)，影響機(jī)體的抗病毒應(yīng)答反應(yīng)。
　　2.與健康對(duì)照者相比，CHB患者外周血中IL-10的水平明顯升高，且與病情密切相關(guān)，提示MDSCs可能通過產(chǎn)生IL-10發(fā)揮免疫抑制作用，促進(jìn)免疫逃逸，導(dǎo)致慢性化。
　　3.抗病毒（恩替

14、卡韋）治療后，CHB患者M(jìn)DSCs水平無明顯改變，提示抗病毒治療可有效抑制病毒復(fù)制，改善炎癥癥狀，但對(duì)MDSCs表達(dá)無影響。
　　4.CHB患者外周血MDSCs與Th1細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)，但與Treg、Tc1細(xì)胞無明顯相關(guān)關(guān)系，提示在慢性乙型肝炎中，MDSCs可能主要通過抑制Th1細(xì)胞的功能來發(fā)揮其免疫抑制作用。
　　5.CHB患者外周血MDSCs的表達(dá)與ALT、HBV-DNA水平呈正相關(guān)，表明MDSCs參與CHB疾病進(jìn)展，若靶向