不同特性納米銀制備及遺傳毒性定量研究.pdf

1、納米技術(shù)的研究熱潮遍布世界各國，納米銀的應(yīng)用前景也不斷被挖掘。納米銀擁有獨(dú)特的抗菌作用，使其大量應(yīng)用于日常用品領(lǐng)域、工業(yè)領(lǐng)域和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。然而研究表明，納米銀能穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞中，甚至進(jìn)入細(xì)胞核中，可能會(huì)引起細(xì)胞核內(nèi)物質(zhì)形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能的改變，誘導(dǎo)染色體畸變、DNA損傷和基因突變。廣泛的應(yīng)用使納米銀在各個(gè)方面接觸人體，并可能與體內(nèi)不同組織、細(xì)胞或生物分子產(chǎn)生相互作用。體內(nèi)研究表明，納米銀能達(dá)到動(dòng)物骨髓細(xì)胞和臟器中，并且停止暴露后能滯留

2、在動(dòng)物臟器中。評(píng)估納米銀對(duì)生物的毒性效應(yīng)至關(guān)重要，尤其是與致癌、致畸、致突變相關(guān)的遺傳毒性效應(yīng)。
　　本研究首先制備出三種不同粒徑的PVP包被納米銀。然后選擇所制備納米銀中分散性良好且粒徑分布集中的納米銀與市場(chǎng)上購買的兩種納米銀一起進(jìn)行遺傳毒性定量評(píng)價(jià)。根據(jù)OECD用于檢測(cè)遺傳毒性致癌物的體內(nèi)外遺傳毒性試驗(yàn)的推薦，再結(jié)合納米銀本身特殊性質(zhì)選擇合適試驗(yàn)方法，采取體外彗星實(shí)驗(yàn)和胞質(zhì)阻滯微核組學(xué)試驗(yàn)與體內(nèi)小鼠骨髓微核試驗(yàn)形成組合試驗(yàn)方案

3、，全面考察不同特性納米銀的遺傳毒性。對(duì)于納米銀體外遺傳毒性研究，本研究選取人肝癌細(xì)胞（HepG2）作為體外評(píng)價(jià)模型，分別利用Hoechst-33258染色、彗星實(shí)驗(yàn)、胞質(zhì)阻滯微核組學(xué)試驗(yàn)定量研究了三種不同特性納米銀(20nmAgNPs，20nmPVP-AgNPs，40nmPVP-AgNPs)染毒的HepG2細(xì)胞核形態(tài)與凋亡率、DNA損傷、染色體畸變等情況。接著使用20nmPVP-AgNPs染毒人肝癌細(xì)胞(Hep G2)和人肺癌細(xì)胞(A5

4、49)24h和48h后進(jìn)行微核實(shí)驗(yàn)，比較納米銀對(duì)不同細(xì)胞遺傳毒性效應(yīng)的差異。用20nmPVP-AgNPs染毒HepG2細(xì)胞24h比較胞質(zhì)阻滯微核微核組學(xué)試驗(yàn)和微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異。對(duì)于納米銀體內(nèi)遺傳毒性研究，開展了兩種不同包被納米銀(20nm AgNPs，20nm PVP-AgNPs)對(duì)小鼠經(jīng)口給藥28天后骨髓微核試驗(yàn)，并考察了小鼠體重變化和骨髓微核率等指標(biāo)的改變。最后選取人肝癌(HepG2)細(xì)胞作為評(píng)價(jià)模型，運(yùn)用彗星實(shí)驗(yàn)與胞質(zhì)阻滯微核組學(xué)

5、試驗(yàn)，研究了市場(chǎng)中某品牌含銀醫(yī)用生物膠體分散劑的遺傳毒性效應(yīng)。得出的主要結(jié)果如下:
　　(1)不同特性納米銀制備及表征結(jié)果。使用馬爾文粒度儀測(cè)得制備所得平均水合粒徑94.84nm、111.1nm、120.7nm的PVP包被納米銀。使用TEM觀察自行制備的納米銀顆粒和兩種市場(chǎng)購買的納米銀顆粒，三種納米銀顆粒平均粒徑分別為39.50±9.09nm、19.95±4.75nm和18.29±5.50nm。
　　(2)體外遺傳毒性研究結(jié)

6、果。在相同染毒條件下，三種不同特性納米銀在各個(gè)濃度凋亡率均是:20nmPVP-AgNPs＞20nmAgNPs＞40nmPVP-AgNPs。在所有處理組實(shí)驗(yàn)劑量下凋亡率均在10.33％以下。研究發(fā)現(xiàn)三種納米銀均可以引起HepG2細(xì)胞DNA損傷增加，但是不同特性納米銀對(duì)細(xì)胞DNA損傷影響具有差異。和對(duì)照組比較，染毒24h后20nmAgNPs組和40nmPVP-AgNPs組中濃度在20μg/mL的Olive尾矩與尾長改變無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，20nm

7、PVP-AgNPs組20μg/mL的DNA百分比改變無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而其余各劑量組各指標(biāo)都反應(yīng)HepG2細(xì)胞DNA損傷程度都增加。三種納米銀使HepG2細(xì)胞DNA損傷程度:20nmAgNPs＞20nmPVP-AgNPs＞40nmPVP-AgNPs。
　　胞質(zhì)阻滯微核組學(xué)試驗(yàn)研究表明，除核質(zhì)橋外，三種材料的各效應(yīng)指標(biāo)均有隨染毒劑量增高而增高的趨勢(shì)。說明本實(shí)驗(yàn)采用的三種不同特性納米銀材料均對(duì)HepG2細(xì)胞染色體丟失、染色體斷裂、基因擴(kuò)增

8、與基因量的改變效應(yīng)呈濃度相關(guān)性。三種材料在相同染毒濃度時(shí)，總微核數(shù)、Ⅰ型微核數(shù)、Ⅱ型微核數(shù)、核芽數(shù)均是20nmPVP-AgNPs＞20nmAgNPs＞40nmPVP-AgNPs。說明在相同包被下，小粒徑納米銀更容易誘發(fā)HepG2細(xì)胞染色體畸變等相關(guān)效應(yīng);在相同粒徑下，PVP包被納米銀比未包被納米銀更容易誘發(fā)HepG2細(xì)胞染色體畸變等相關(guān)效應(yīng)。
　　兩種不同方法對(duì)比研究結(jié)果。微核試驗(yàn)研究表明不同濃度20nm PVP-AgNPs染毒A

9、549細(xì)胞和HepG2細(xì)胞24h、48h后，兩株細(xì)胞的兩種染毒時(shí)間內(nèi)均呈濃度-效應(yīng)關(guān)系。在劑量小于等于80μg/mL時(shí)，兩株細(xì)胞各濃度微核數(shù)均是染毒后24h大于染毒48h，而在劑量為160μg/mL時(shí)，兩株細(xì)胞在染毒48h后的微核數(shù)大于24h。在染毒24h時(shí)，40～160μg/mL的A549細(xì)胞和20～160μg/mL劑量范圍內(nèi)的HepG2細(xì)胞微核數(shù)變化均出現(xiàn)顯著性差異，說明在納米銀染毒24h時(shí)HepG2細(xì)胞微核數(shù)變化敏感度高于A549

10、細(xì)胞。比較用胞質(zhì)阻滯微核微核組學(xué)試驗(yàn)和微核實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)20nmPVP-AgNPs染毒HepG2細(xì)胞24h在20～160μg/mL劑量范圍內(nèi)都呈現(xiàn)陽性結(jié)果。結(jié)果表明胞質(zhì)阻滯微核組學(xué)試驗(yàn)表現(xiàn)出比微核試驗(yàn)檢測(cè)出更多的微核率。提示納米銀的遺傳毒性沒有受細(xì)胞松弛素B影響而減弱遺傳毒性效應(yīng)。說明相比于傳統(tǒng)的微核實(shí)驗(yàn)，胞質(zhì)阻滯微核組學(xué)試驗(yàn)是一種可以用作測(cè)定納米銀遺傳毒性的全面而靈敏的實(shí)驗(yàn);HepG2細(xì)胞株適宜作為胞質(zhì)阻滯微核組學(xué)試驗(yàn)體外評(píng)估納米銀的模

11、型。
　　(3)體內(nèi)遺傳毒性研究結(jié)果。不同包被納米銀小鼠骨髓微核試驗(yàn)研究表明，20nmAgNPs組在本試驗(yàn)設(shè)計(jì)劑量50mg/kg內(nèi)在灌胃28天內(nèi)對(duì)小鼠體質(zhì)量無明顯影響。20nmPVP-AgNPs組劑量10mg/kg內(nèi)在灌胃28天內(nèi)對(duì)小鼠體質(zhì)量無明顯影響。不同包被納米銀引起小鼠骨髓微核率改變結(jié)果表明，20nm無包被納米銀在50mg/kg劑量內(nèi)和灌胃28天內(nèi)對(duì)小鼠骨髓微核率無明顯影響。20nmPVP-AgNPs劑量10mg/kg內(nèi)在灌

12、胃28d內(nèi)對(duì)小鼠骨髓微核率無明顯影響。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在高劑量250mg/kg下，納米銀能導(dǎo)致小鼠體內(nèi)細(xì)胞產(chǎn)生染色體畸變效應(yīng)。20nmPVP-AgNPs對(duì)小鼠體重和骨髓微核率影響均大于20nm無包被納米銀。
　　(4)選取人肝癌(HepG2)細(xì)胞作為評(píng)價(jià)模型，運(yùn)用彗星實(shí)驗(yàn)與胞質(zhì)阻滯微核組學(xué)試驗(yàn)，研究了市場(chǎng)中某品牌含銀醫(yī)用生物膠體分散劑的遺傳毒性效應(yīng)結(jié)果。超微量微孔板分光光度計(jì)檢測(cè)某品牌含銀醫(yī)用生物膠體分散劑結(jié)果顯示未出現(xiàn)納米銀顆粒特征吸

13、收峰，而馬爾文粒徑分析儀檢測(cè)結(jié)果顯示有顆粒特征吸收峰的出現(xiàn)，考慮到是由該分散劑中有膠體顆粒團(tuán)聚或者存在的極微量納米銀顆粒存在造成的。由此得出“某品牌含銀醫(yī)用生物膠體分散劑”中銀的成分可能主要為銀離子膠團(tuán)。彗星實(shí)驗(yàn)和胞質(zhì)阻滯微核組學(xué)試驗(yàn)測(cè)定分散劑對(duì)HepG2細(xì)胞遺傳毒性結(jié)果表明，Olive尾矩、尾長、尾部DNA百分比和Ⅱ型微核數(shù)均在0.125μg/mL和0.25μg/mL時(shí)與空白對(duì)照組有差異。說明在0.125μg/mL和0.25μg/mL

14、劑量下某品牌含銀醫(yī)用生物膠體分散劑可能引起HepG2細(xì)胞DNA和染色體丟失。
　　綜上所述，本研究探討了不同特性納米銀體內(nèi)外遺傳毒性差異，包括DNA損傷、染色體丟失、染色體斷裂、基因擴(kuò)增與基因量的改變等效應(yīng)。結(jié)果表明相同粒徑下，無包被納米銀比PVP包被納米銀更容易引起DNA損傷，PVP包被納米銀比無包被納米銀更容易引起細(xì)胞和動(dòng)物染色體畸變相關(guān)效應(yīng)。體外遺傳毒性實(shí)驗(yàn)彗星實(shí)驗(yàn)和胞質(zhì)阻滯微核組學(xué)試驗(yàn)表明，在相同包被下，小粒徑納米銀比大粒

15、徑納米銀更容易誘發(fā)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生DNA損傷、染色體丟失、染色體斷裂、基因擴(kuò)增與基因量的改變。體外微核試驗(yàn)和體內(nèi)微核實(shí)驗(yàn)之間在不同特性納米銀遺傳毒性強(qiáng)弱方面有良好相關(guān)性。胞質(zhì)阻滯微核組學(xué)試驗(yàn)和微核實(shí)驗(yàn)測(cè)定納米銀引起HepG2細(xì)胞染色體畸變效應(yīng)差異比較結(jié)果表明相比于傳統(tǒng)的微核實(shí)驗(yàn)，胞質(zhì)阻滯微核組學(xué)試驗(yàn)是一種可以用作測(cè)定納米銀遺傳毒性的全面而靈敏的試驗(yàn)。由彗星實(shí)驗(yàn)與胞質(zhì)阻滯微核組學(xué)試驗(yàn)結(jié)合，利用HepG2細(xì)胞作為體外評(píng)價(jià)模型，能方便快速檢