與人遺傳病相關(guān)的DNA重復(fù)序列PCR條件優(yōu)化及遺傳不穩(wěn)定性的研究.pdf

1、近年來,人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)40余種人類神經(jīng)系統(tǒng)疾病與DNA重復(fù)序列擴增或刪除有關(guān),這些疾病所涉及的重復(fù)序列的一個共同特點是以非孟德爾遺傳方式在世代間發(fā)生動態(tài)突變,且往往伴隨著遺傳早現(xiàn)現(xiàn)象。
　　進行與人類遺傳病相關(guān)的重復(fù)序列的遺傳不穩(wěn)定性的研究時,應(yīng)用PCR檢測重組質(zhì)粒內(nèi)含有的重復(fù)序列長度是一個基本的實驗方法。我們采用L9(34)正交實驗法,對與人神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)的DNA重復(fù)序列PCR擴增體系中的模板DNA濃度、Taq酶濃度、引物濃度、

2、dNTP濃度等4種影響因素進行了優(yōu)化篩選,發(fā)現(xiàn)引物濃度對擴增結(jié)果影響的顯著性最大。在此基礎(chǔ)上進行了引物濃度單因素實驗,得到最優(yōu)DNA重復(fù)序列PCR擴增體系在25μL反應(yīng)體系中各組分的最適濃度分別為:模板3 ng/μL、Taq酶0.75 U、dNTP0.25 mmol/L、引物0.3μmol/L。通過優(yōu)化前后反應(yīng)體系的對比,擴增目的產(chǎn)物的量有較大程度的提高。該優(yōu)化體系的建立為進一步研究和人遺傳病相關(guān)的DNA重復(fù)序列的遺傳不穩(wěn)定性奠定了基礎(chǔ)

3、。
　　在研究人類神經(jīng)系統(tǒng)疾病的遺傳不穩(wěn)定性及藥物作用的影響時,需要制備成百上千的PCR樣品進行定性檢測重復(fù)序列的長度變化情況。為了探索含重復(fù)序列質(zhì)粒PCR模板的快速簡易制備方法,本文分別利用高速離心法、TE煮沸法和TE/SDS煮沸法處理過夜培養(yǎng)的含重組質(zhì)粒大腸桿菌菌體,制備模板后進行PCR擴增發(fā)現(xiàn),均能得到比較清晰的目的條帶,可以用于含重復(fù)序列質(zhì)粒的初步鑒定。相比較而言,高速離心5min、TE煮沸3min、TE/SDS煮沸2.5

4、min制備的樣品PCR擴增后效果較好。這三種方法快速、簡便、費用低、無污染,簡化了PCR模板制備的過程,為藥物處理后重復(fù)序列長度大量鑒定的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　多核苷酸的重復(fù)只有超過一定的閾值時才可能導(dǎo)致遺傳病的發(fā)生,如果能夠控制重復(fù)次數(shù)從而抑制其擴增或運用一種方法使擴增的重復(fù)序列刪除縮短,對于由 DNA重復(fù)序列引起的神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病的治療及預(yù)防具有非常重要的意義。我們利用絲裂霉素C和甲基磺酸乙酯兩種化學(xué)藥物,在10％的菌體存活率下