抗原活化誘導(dǎo)的輔助性T細(xì)胞凋亡參與血吸蟲感染不同階段Th1-Th2免疫應(yīng)答極化的研究.pdf

1、未致敏CD4+T細(xì)胞在外周淋巴組織中接觸到病原體抗原后，可分化成Th1和Th2兩大類CD4+效應(yīng)T細(xì)胞.Th1細(xì)胞主要分泌IL-2、IFN-γ和TNF-β等細(xì)胞因子，參與細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)介導(dǎo)的細(xì)胞免疫，主要在抗細(xì)胞內(nèi)感染(如病毒感染、結(jié)核分枝桿菌感染等)中發(fā)揮重要作用；而Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10及IL-13等細(xì)胞因子，其功能主要在于刺激B細(xì)胞增殖及嗜酸性粒細(xì)胞活化，促進(jìn)抗體(IgGl與IgE)產(chǎn)

2、生，參與體液免疫，在抗細(xì)胞外感染與致敏原引起的免疫應(yīng)答中起主要作用. 血吸蟲病是典型的在不同感染階段具有Th1、Th2免疫應(yīng)答優(yōu)勢(shì)發(fā)生漂移與極化現(xiàn)象的慢性感染.在血吸蟲感染過程中，宿主免疫應(yīng)答大致可以劃分成三個(gè)階段.以小鼠感染模型為例，感染日本血吸蟲后，在感染約21-25天(3-3.5周)，免疫應(yīng)答以Th1型為主，主要由尾蚴、童蟲及成蟲等非蟲卵抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生.從26-28天(3.5～4周)左右起始，成蟲開始產(chǎn)卵，35天(5周)左右

3、體內(nèi)細(xì)胞因子內(nèi)環(huán)境出現(xiàn)轉(zhuǎn)變，即從Thl優(yōu)勢(shì)應(yīng)答逐漸向Th2優(yōu)勢(shì)應(yīng)答偏移.至56天(8周)后，體內(nèi)則明顯轉(zhuǎn)變?yōu)橛上x卵抗原誘導(dǎo)的Th2優(yōu)勢(shì)應(yīng)答.感染約91天(13周)，感染進(jìn)入性期，此時(shí)Th1、Th2免疫應(yīng)答均維持于不太高的平臺(tái)期，但仍以Th2型免疫應(yīng)答占優(yōu)勢(shì). 許多因素影響著Th1/Th2應(yīng)答的極化方向，包括：抗原的劑量及形式、抗原肽與TCR的親和性、抗原遞呈細(xì)胞(APC)的類型、共刺激分子及細(xì)胞因子的影響等.近年來已有研究發(fā)現(xiàn)T

4、h1、Th2細(xì)胞對(duì)TCR誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(TCR-ICD)的敏感性不同，但是對(duì)病原體的不同抗原在感染不同階段通過誘導(dǎo)不同的Th細(xì)胞凋亡從而影響Th1/Th2極化的研究則幾乎沒有. 在本研究中，我們首先建立了血吸蟲感染組小鼠(感染鼠體內(nèi)有非蟲卵及蟲卵抗原)及感染合并青蒿琥酯(Artesunate)化療組小鼠(使感染鼠體內(nèi)不含有蟲卵抗原)模型，應(yīng)用流式細(xì)胞儀，動(dòng)態(tài)觀察了感染后23、35、56天小鼠Th1、Th2細(xì)胞內(nèi)凋亡關(guān)鍵分子eas

5、pase-3水平的變化，隨后檢測(cè)了SWA、SEA免疫小鼠的Th1、Th2細(xì)胞內(nèi)caspase-3水平以及正常CD4+T細(xì)胞體外SWA、SEA刺激后產(chǎn)IFN-γ及IL-4細(xì)胞內(nèi)easpase-3水平的變化，最后在SWA、SEA免疫小鼠后，用SWA、SEA體外再刺激小鼠單個(gè)核淋巴細(xì)胞同時(shí)加入easpase或GrB的抑制劑，并用TUNEL法檢測(cè)Th1、Th2細(xì)胞凋亡情況.本研究獲得如下主要結(jié)果： 1.在自然感染過程中，感染23天小鼠體

6、內(nèi)呈現(xiàn)Th1類優(yōu)勢(shì)應(yīng)答，此時(shí)Th2細(xì)胞的凋亡比例(10.16％)明顯高于Th1細(xì)胞(6.77％).感染35天，血吸蟲成蟲已經(jīng)產(chǎn)卵，小鼠體內(nèi)細(xì)胞因子內(nèi)環(huán)境正出現(xiàn)一個(gè)轉(zhuǎn)變過程，在Th1、Th2應(yīng)答都增強(qiáng)的同時(shí)，從Th1優(yōu)勢(shì)應(yīng)答逐漸向Th2優(yōu)勢(shì)應(yīng)答偏移(即Th2類細(xì)胞因子逐漸增加并超過Th1類細(xì)胞因子)，此時(shí)，小鼠體內(nèi)Th1細(xì)胞凋亡比例增加(7.60％)，然而Th2細(xì)胞凋亡比例減少(5.95％).至感染56天，小鼠體內(nèi)免疫應(yīng)答主要是蟲卵抗原誘

7、導(dǎo)的Th2型免疫應(yīng)答，此時(shí)Th1凋亡比例繼續(xù)增加(9.66％)，而Th2細(xì)胞凋亡比例與感染35天時(shí)未有明顯變化(6.18％).感染合并化療后23天小鼠也以Th1類免疫應(yīng)答為主，此時(shí)體內(nèi)Th2細(xì)胞凋亡比例(11.72％)明顯高于Th1細(xì)胞凋亡(6.89％)，與感染23天小鼠結(jié)果一致.感染35天小鼠體內(nèi)存在蟲卵抗原，而感染合并化療35天小鼠體內(nèi)無蟲卵抗原，此時(shí)體內(nèi)Th1細(xì)胞凋亡比例，感染組小鼠(7.60％)比感染合并化療組小鼠(4.58％)

8、高，而Th2細(xì)胞凋亡比例，感染組(5.95％)比感染合并化療組(11.70％)低.隨著感染時(shí)間延長(zhǎng)，感染56天時(shí)免疫應(yīng)答主要表現(xiàn)為蟲卵抗原誘導(dǎo)的Th2優(yōu)勢(shì)應(yīng)答，此時(shí)，感染組小鼠Th1細(xì)胞凋亡比例(9.66％)與感染合并化療組小鼠(5.61％)相比，提示前者在體內(nèi)能夠更強(qiáng)地誘導(dǎo)，Th1細(xì)胞凋亡.由此推測(cè)，日本血吸蟲感染早期，非蟲卵抗原可能優(yōu)勢(shì)誘導(dǎo)Th2細(xì)胞凋亡，從而更有利于Th1極化的形成；成蟲產(chǎn)卵后，蟲卵抗原可能通過優(yōu)勢(shì)誘導(dǎo)TH1細(xì)胞凋

9、亡，從而更有利于Th2極化的形成. 血吸蟲自然感染后結(jié)合SWA、SEA體外抗原刺激，這一現(xiàn)象則更明顯：感染23天的Th細(xì)胞，SWA體外刺激后，Th2細(xì)胞凋亡比例(17.69％)明顯高于Th1細(xì)胞(13.33％).而感染合并化療組23天時(shí)，Th2細(xì)胞凋亡比例(19.41％)也明顯高于Th1細(xì)胞凋亡(12.88％).感染35天血吸蟲產(chǎn)卵后，加用SEA體外刺激，Th2細(xì)胞凋亡比例(14.79％)仍稍高于Th1細(xì)胞(12.24％).而感

10、染56天，結(jié)合體外SEA刺激后，Th1細(xì)胞凋亡比例(14.78％)明顯高于Th2細(xì)胞凋亡比例(10.41％).體外加用SEA抗原刺激后，感染組與感染合并化療組相比，感染35天體內(nèi)Th1細(xì)胞凋亡比例(12.24％)明顯高于感染合并化療組Th1細(xì)胞凋亡比例(7.58％)；而感染合并化療35天Th2凋亡比例(15.73％)則略高于感染組Th2細(xì)胞凋亡比例(14.79％).感染56天小鼠體內(nèi)Th1凋亡比例(14.78％)與感染合并化療組Th1凋

11、亡比例(6.80％)相比，則增高得更明顯；而Th2細(xì)胞凋亡比例(10.41％)則低于感染合并化療組Th2凋亡比例(13.51％). 為進(jìn)一步佐證非蟲卵抗原與蟲卵抗原誘導(dǎo)Th1/Th2凋亡的傾向性，我們分別用SWA，SEA免疫正常小鼠，觀察到，SWA免疫的小鼠，Th2細(xì)胞凋亡比例(12.27％)明顯高于Th1細(xì)胞凋亡比例(6.64％)；而SEA免疫的小鼠，Th1細(xì)胞凋亡比例(8.34％)明顯高于Th2細(xì)胞凋亡比例(6.99％)我們

12、又用磁珠分選出正常小鼠的CD4+T細(xì)胞，用SWA，SEA分別進(jìn)行體外刺激，檢測(cè)兩種細(xì)胞凋亡情況，類似地，這個(gè)實(shí)驗(yàn)同樣也支持了我們的觀點(diǎn). 2.我們用SWA、SEA分別刺激SWA或SEA免疫小鼠后的單個(gè)核淋巴細(xì)胞后，再分別加入GrB抑制劑Z-AAD-CMK或caspase抑制劑Z-VAD-FMK，隨后用TUNEL法檢測(cè)Th1、Th2細(xì)胞凋亡.結(jié)果顯示，SWAP誘導(dǎo)的Th2凋亡可部分被GrB抑制劑阻斷，SEA誘導(dǎo)的Th1凋亡可部分被

13、caspase抑制劑阻斷.可見在血吸蟲感染過程中不同抗原誘導(dǎo)不同Th細(xì)胞的凋亡可能也與其分別優(yōu)先激活Th1、Th2細(xì)胞中不同的凋亡通路相關(guān). 綜上所述，本研究中我們發(fā)現(xiàn)，血吸蟲感染過程中，感染早期，非蟲卵抗原似乎更多地誘導(dǎo)Th2細(xì)胞凋亡從而有利于Th1極化的形成；產(chǎn)卵后，蟲卵抗原可能更易于誘導(dǎo)Th1細(xì)胞凋亡，從而有利于Th2極化的形成.我們還探討了這一現(xiàn)象可能存在的機(jī)制，非蟲卵抗原可能是通過GrB凋亡途徑優(yōu)勢(shì)誘導(dǎo)Th2細(xì)胞凋亡從