響應(yīng)曲面法用于救必應(yīng)等三種藥材高效提取及其提取物的藥理活性研究.pdf

1、近年來(lái)，響應(yīng)曲面法(Response surface methodology，RSM)作為一種重要的統(tǒng)計(jì)學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)廣泛應(yīng)用于生物過(guò)程。通過(guò)RSM可以建立連續(xù)變量三維曲面模型，對(duì)影響生物過(guò)程變量及其交互作用進(jìn)行有效評(píng)價(jià)，從而確定最佳變量范圍。RSM優(yōu)化生物過(guò)程所需試驗(yàn)組數(shù)相對(duì)較少，省時(shí)省力，實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單，預(yù)測(cè)性好，因此該方法已經(jīng)成功應(yīng)用到多種生物過(guò)程的優(yōu)化。此外，RSM亦在中藥有效成分提取研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。本論文主要應(yīng)用響應(yīng)曲面法深入探討其在

2、中藥五味子，救必應(yīng)，大黃等三種藥用植物有效成分提取中的應(yīng)用，確定最佳提取變量，優(yōu)化提取條件。此外，本文對(duì)傳統(tǒng)“清熱解毒”中藥——救必應(yīng)的的抗腫瘤和肝損傷保護(hù)作用進(jìn)行初步研究。論文共分六章。
　　第1章,主要是介紹響應(yīng)曲面法的理論方法及其在中藥有效成分提取中的應(yīng)用研究。對(duì)深入藥理活性研究的藥用植物救必應(yīng)的化學(xué)成分及藥理活性報(bào)道做一綜述。查閱文獻(xiàn)總結(jié)概括了藥用植物五味子中木脂素類(lèi)成分提取工藝研究、救必應(yīng)中有效成分的提取工藝研究、大黃中

3、蒽醌類(lèi)成分的提取工藝研究。
　　第2章,運(yùn)用響應(yīng)曲面法（RSM）優(yōu)化加速溶劑萃?。ˋSE）五味子中四種木脂素類(lèi)成分（五味子素，五味子醇乙，五味子甲素和五味子乙素）。通過(guò)RSM建立數(shù)學(xué)模型，利用Behnken設(shè)計(jì)，獲得提取條件的優(yōu)化組合。從數(shù)學(xué)模型的三維響應(yīng)曲面圖和等高線(xiàn)圖，以確定五味子中四種木脂素最佳提取條件如下：提取溶劑為87％的乙醇，提取溫度為160℃，靜態(tài)萃取時(shí)間為10分鐘，提取壓力為1500psi，一個(gè)提取周期的沖水量為6

4、0％。結(jié)果表明：五味子中四種木脂素的實(shí)驗(yàn)值14.72mg/g，結(jié)果與模型預(yù)測(cè)值較為一致。
　　第3章,本章中利用建立超聲波輔助提取（UAE）結(jié)合響應(yīng)曲面法（RSM）提取救必應(yīng)中紫丁香苷。通過(guò)高效液相色譜法（HPLC-UV）對(duì)紫丁香苷進(jìn)行分析和定量。利用Box-Behnkendesign（BBD）設(shè)計(jì)對(duì)提取溶劑、提取溫度和提取時(shí)間等三個(gè)主要變量進(jìn)行了優(yōu)化以獲得最高的提取效率。結(jié)果表明：救必應(yīng)中紫丁香苷的最佳條件為超聲處理頻率40Hz

5、，65％乙醇作為提取溶劑，提取時(shí)間30分鐘，提取溫度40℃。在最優(yōu)提取條件下，預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值一致。方差分析結(jié)果表明：模型的擬合度高，RSM方法可以用于優(yōu)化救必應(yīng)中紫丁香苷的提取純化。
　　第4章在本章中，采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化結(jié)合超聲波輔助提取（UEA）大黃中的五種蒽醌類(lèi)成分（蘆薈大黃素，大黃酸，大黃素，大黃酚和大黃素甲醚）。采用高效液相色譜（HPLC-UV）對(duì)五種蒽醌類(lèi)成分進(jìn)行分析和定量。利用RSM對(duì)影響UEA的三個(gè)主要因素參數(shù)（提

6、取溶劑，提取溫度和提取時(shí)間）進(jìn)行了優(yōu)化，以期獲得最高的提取效率。結(jié)果表明：最佳提取條件為84％甲醇作為溶劑，提取時(shí)間為33分鐘，提取溫度67℃。這些最佳條件下，實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值較為接近。結(jié)果可靠，RSM適用于超聲波提取大黃中的蒽醌類(lèi)成分。
　　第5章,利用先前獲得就必應(yīng)提取物進(jìn)行C57小鼠體內(nèi)抗腫瘤作用的研究，對(duì)其抑瘤率，免疫器官指數(shù)及血清學(xué)指標(biāo)進(jìn)行探討，給藥14天后觀察發(fā)現(xiàn)：各給藥組對(duì)小鼠體重基本無(wú)影響，救必應(yīng)高中劑量組可以顯著抑

7、制腫瘤增長(zhǎng)，具有顯著的抑瘤率；免疫學(xué)指標(biāo)結(jié)果表明：救必應(yīng)可以顯著升高胸腺指數(shù)，降低肝指數(shù)，對(duì)免疫器官具有一定的保護(hù)作用。通過(guò)檢測(cè)肝臟中ALT和AST含量，進(jìn)一步明確，救必應(yīng)提取物可以改善荷瘤小鼠的肝功能，與免疫組織指數(shù)結(jié)果相一致，驗(yàn)證中藥抗腫瘤主要通過(guò)增強(qiáng)免疫力而發(fā)揮作用。
　　第6章,本章利用CCl4和單次大劑量酒精誘導(dǎo)小鼠肝臟損傷模型，探討救必應(yīng)提取物對(duì)肝損傷小鼠的影響，比較了各給藥組對(duì)肝損傷小鼠血清中ALT，AST，肝臟中S

8、OD和MDA活性的影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組比較，救必應(yīng)提取物均能降低血清中增加的ALT和AST活性及TG濃度，結(jié)果說(shuō)明，救必應(yīng)提取物對(duì)細(xì)胞膜有一定的保護(hù)作用。SOD是細(xì)胞內(nèi)天然存在的氧自由基清除劑，可以平衡細(xì)胞內(nèi)氧化和抗氧化作用，阻止氧化應(yīng)激作用的發(fā)生，SOD活性的高低反映了機(jī)體清除自由基的能力。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，MDA濃度的高低可以反映機(jī)體細(xì)胞膜受自由基破壞的程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，救必應(yīng)給藥組對(duì)SOD和MDA均有一定