所謂肺硬化性血管瘤中的兩種主要細胞的基因表達差異及意義.pdf

1、 肺硬化性血管瘤(pulmonary sclerosing hemangioma)是由Liebow和Hulbell首先報道的肺部較為少見腫瘤，約占肺腫瘤的2—3％，最初認為是黃色瘤或錯構瘤，長期以來被歸類于肺的炎性假瘤范疇。隨著時間的推移，人們逐漸認識到：肺的硬化性血管瘤并不是肺的炎性假瘤，而是一種實實在在的“良性”真性腫瘤，盡管其發(fā)病率較低，但由于臨床CT、磁共振等影像學檢查極易與肺癌相混淆，更為嚴重的是術中冰凍病理診斷又極易

2、誤診為肺腺癌、細支氣管肺泡癌以及類癌等，因而手術切除常常過度，給患者造成損害，所以對該腫瘤的研究和診斷備受重視。在我們的研究中，為了區(qū)分該腫瘤并不是炎性假瘤，也為了將來能夠有一個更適合該腫瘤的名字。我們將該腫瘤稱之為“所謂的肺硬化性血管瘤”(So—called pulmonary sclerosing hemangioma，PSH)。由于該腫瘤一般呈良性臨床經(jīng)過，與其相平行的名稱還有：良性乳頭狀神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，良性肺泡細胞瘤，良性肺腺瘤

3、，錯構瘤等。之所以出現(xiàn)這些名稱，是因為到目前為止PSH的起源尚不清楚。有人認為來源于內(nèi)皮細胞、間皮細胞、肺泡上皮細胞、神經(jīng)內(nèi)分泌細胞等，最近還有人提出是來源于多潛能的原始呼吸道上皮細胞的觀點。在新版的WHO分類當中，也只好將該腫瘤暫時放入“未定類腫瘤”當中。有人還對該腫瘤當中兩種主要形態(tài)不同的細胞是否為同一起源提出了質(zhì)疑，并觀察到部分腫瘤術后若干年出現(xiàn)了復發(fā)和轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。 針對PSH的分類困難、影像和病理診斷困難、起源不明、生物

4、學特性不清的特點，我們收集了40余例的PSH資料，利用免疫組化、激光捕獲微切割(LCM)、RT-PCR、單鏈構象多態(tài)性分析和DNA測序分析等方法，對該腫瘤進行系統(tǒng)深入的研究，期望找到能正確診斷該腫瘤的方法，并對其起源及生物學行為方面作以探討。 材料與方法： 1、材料 收集中國醫(yī)科大學第一臨床學院1995～2004年間病理診斷為PSH及手術切除病變旁正常肺組織蠟塊標本40例。選其中17例女性，2例男性具有完整臨床資

5、料的病例進行基因表達方面的研究。該19例當中，12例無自覺癥狀，為體檢時發(fā)現(xiàn)；7例有癥狀者分別表現(xiàn)為胸痛、咳嗽、痰中帶血。胸部X線片或胸部CT顯示均為孤立性腫塊，多位于肺的周邊，呈圓形、卵圓形高密度影，邊緣光滑，無毛刺及分葉狀改變。腫塊位于右肺11例，左肺8例。未發(fā)現(xiàn)多發(fā)病灶及轉(zhuǎn)移病例。發(fā)病時間為15天至5年不等。 2、免疫組化 選用單克隆抗體細胞角蛋白(cytokeratin L，CK—L)、上皮膜抗原(epithel

6、ial membrane antigen，EMA)標記上皮性抗原，SP—B和TTF—1標記原始呼吸道上皮細胞或肺泡Ⅱ型細胞，波形蛋白(vimentin，VT)標記間葉來源細胞，CD34標記內(nèi)皮來源細胞，CD68標記巨噬細胞，神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific endolase，NSE)和突觸素(synaptophysin，Syn)標記神經(jīng)內(nèi)分泌來源的細胞以及單克隆P53抗體(D0-7)。上述即用型抗體及S-P超敏試劑盒

7、均購自福州邁新物技術公司。將蠟塊標本制成4μm連續(xù)切片，經(jīng)脫蠟、脫苯、水化后進行HE和鏈菌素抗生物素蛋白—過氧化物酶(S-P法)免疫組化染色。以已知陽性組織為陽性對照，PBS緩沖液代替一抗為陰性對照。每張切片隨機選取5個高倍視野，每高倍視野計數(shù)100個瘤細胞，無著色及陽性細胞數(shù)<5％為(-)，陽性細胞數(shù)>5％為(+)。CK—L、SP—B、Vimentin、CD34、CD68、NSE、Syn陽性表達的判斷為單純胞質(zhì)表達；EMA陽性表達的判

8、斷為膜/質(zhì)表達；TTF—1、p53陽性表達的判斷為單純核表達或核、胞質(zhì)同時表達。 3、激光捕獲目的細胞、提取總RNA 取病變組織蠟塊，制成6μm連續(xù)切片，Mayer's蘇木素—伊紅染色，二甲苯透明，切片晾干，放置在激光捕獲顯微切割(lasercapture microdissection，LCM)系統(tǒng)(LM200型)的倒置顯微鏡的載物臺上。將附有一層乙烯乙酸乙烯酯薄膜(et hylenevinylacetate poly

9、mer，EVA)的扁平塑料帽緊密覆蓋在切片的表面。定位光束標定被選細胞，發(fā)射激光束，分別捕獲PSH組織中表面立方細胞和多角形細胞。每份標本分別捕獲5000～10000個目的細胞。按照PieoPureTM RNA Isolation Kit說明書操作提取總PdqA(Arcturus Bioscience，Mt．View，CA)。 4、RT-PCR 按照RiboAmp()HS RNA Amplification Kit說明書

10、操作。PCR擴增產(chǎn)物使用1.5％瓊脂糖，100V電泳35min，溴化乙啶(EB)染色，凝膠成像系統(tǒng)(BioImageing System，UVP，CA)下觀察。以β—actin為內(nèi)對照。 5、DNA提取、P53基因PCR擴增、SSCP及測序分析 將捕獲的PSH組織中表面立方細胞和多角形細胞加入預先加有50μL DNA裂解液(10 mmol/L Tris HCl，pH8.0；1 mmol/L EDTA PH8.0；1％Tw

11、een20；200 mg/L蛋白酶K)的0.5 mL離心管上。48℃水浴14 h，95℃10 min滅活蛋白酶K，—20℃保存?zhèn)溆?。分別取多角形細胞和立方細胞的DNA模板各10μL于50μL PCR反應體系進行P53基因(5～8外顯子)PCR擴增。取6μL PCR產(chǎn)物加等量變性上樣緩沖液混勻后，100℃熱變性10 min后迅速置于冰水浴中冷卻5 min，然后上樣于10％非變性聚丙烯酰胺凝膠(49：1)中；每組均以病變旁正常肺組織作對照。

12、恒溫電泳。凝膠經(jīng)硝酸銀染色。判斷標準：待測樣品的電泳帶與正常對照的電泳帶相比，若出現(xiàn)條帶的增加、減少或位置的移動，即說明該樣品存在著基因突變。同時取剩余的p53基因(5～8外顯子)擴增產(chǎn)物(40μL左右)進行測序分析(上海聯(lián)合基因測序部)。 結果： 1、組織學改變 PSH組織形態(tài)多樣，由實性區(qū)、乳頭區(qū)、血管瘤樣區(qū)和硬化區(qū)四種基本結構構成，并有不同程度的相互移行。腫瘤細胞主要有兩種：一種是位于實性區(qū)和乳頭區(qū)內(nèi)的多

13、角形瘤細胞，胞漿淡染或嗜酸，核圓或卵圓形，有小核仁，罕見或無核分裂像。另一種是被覆在乳頭表面、血管瘤樣區(qū)間隙及實性區(qū)裂隙內(nèi)的細胞，多呈矮立方狀，形態(tài)與肺泡Ⅱ型細胞極為相似，可融合成多核巨細胞，但無異型性。間質(zhì)內(nèi)可見較多的肥大細胞和以淋巴細胞為主的各種炎性細胞浸潤，還可見含鐵血黃素沉積、鈣化和骨化等。多核瘤巨細胞和硬化性乳頭的出現(xiàn)，是造成診斷困難的原因之一。 2、免疫組化結果 在40例PSH標本中，CK—L、EMA和SP—

14、B只表達在表面立方上皮細胞或?qū)嵭詤^(qū)內(nèi)陷的立方上皮細胞和血管瘤樣區(qū)的內(nèi)襯上皮細胞，而間質(zhì)多角形細胞為陰性；Vimentin則只表達于間質(zhì)的多角形細胞；TTF—1在兩種細胞內(nèi)均有表達；CD34只在血管內(nèi)皮細胞表達，在兩種細胞內(nèi)均無表達；多核瘤巨細胞則表達CK—L，SP—B和TTF—1，而CD68為陰性。此外，間質(zhì)多角形細胞少量表達Syn和NSE。19例PSH組織中，3例(15.8％)標本p53蛋白呈陽性表達，且多角形細胞的表達強度高于表面立

15、方細胞的表達；15例(78.9％)p53蛋白呈陰性表達，其中1例標本雖有p53蛋白呈陽性反應的細胞，但陽性細胞數(shù)≤5％。 3、RT-PCR結果 應用LCM方法，分別提取19例PSH當中的兩種細胞的mRNA，RT-PCR擴增電泳后，所謂肺硬化性血管瘤組織中的兩種細胞，其基因表達有著明顯的區(qū)別，表面立方細胞有明確的CK、EMA、SP—B和TTF—1的mRNA表達，而間質(zhì)內(nèi)的多角形細胞有明確的Vimentin、Syn和TTF—

16、1的表達，同時有弱的EMA的表達。兩種細胞都未見Ch—A的表達。這一結果與免疫組化的蛋白表達結果極為相似。 4、SSCP及測序分析 SSCP法檢測19例PSH組織P53基因突變，3例(15.8％)標本出現(xiàn)異常移動帶，1例發(fā)生在第6外顯子上，2例發(fā)生在第7外顯子上，第5及第8外顯子未見異常；在這3例突變中，單一多角形細胞突變2例，立方細胞和多角形細胞同時突變1例。DNA測序分析結果顯示19例PSH組織中，P53基因的突變

17、率為15.8％(3/19)；單一多角形細胞突變2例，多角形細胞和立方細胞同時突變1例；1例發(fā)生在第6外顯子；2例發(fā)生在第7外顯子，第5、8外顯子未見突變；3例均為錯義突變。 結論： 1、PSH組織當中的多核瘤巨細胞是表面立方細胞的融合，多核瘤巨細胞和硬化性乳頭的出現(xiàn)，是造成病理診斷困難的主要原因之一。 2、PSH組織中的多角形細胞和表面立方細胞在形態(tài)表型上的差異可能是由于所處不同的分化狀態(tài)所致，表面立方細胞趨向肺