所謂肺硬化性血管瘤組織起源及性質(zhì)的研究.pdf

1、所謂肺硬化性血管瘤(So-calledpulmonarysclerosinghemangioma，PSH)是一種迄今未能確定其組織來源及性質(zhì)的少見肺腫瘤。PSH組織主要由兩種形態(tài)不同的細(xì)胞成分構(gòu)成，多角形細(xì)胞是腫瘤的主要成分，來自于原始呼吸道上皮，但被覆在乳頭區(qū)表面和襯覆在腔隙內(nèi)表面的立方細(xì)胞究竟是腫瘤成分還是反應(yīng)性增生，尚未達成共識，且多角形細(xì)胞與表面立方細(xì)胞是否為同一起源，也尚有爭議。盡管絕大多數(shù)PSH有“良好的”臨床經(jīng)過，但仍有報

2、道少數(shù)病例存在向周圍間質(zhì)或支氣管浸潤和局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。為進一步證實PSH中兩種主要細(xì)胞的起源和其可能的性質(zhì)，我們應(yīng)用激光捕獲顯微切割(lasercapturemicro-dissection，LCM)技術(shù)分別捕獲PSH組織中兩種主要細(xì)胞，并進行X染色體連鎖的雄激素基因(AR)和磷酸甘油酸酯激酶基因(PGK)多態(tài)性的克隆性分析，探討PSH組織中多角形細(xì)胞和表面立方細(xì)胞是否具有同源性；同時選用與人類腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的p53基因作為研究

3、對象，應(yīng)用免疫組織化學(xué)S-P法、LCM技術(shù)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Single-strandedConformationPolymorphism，SSCP)及測序分析法檢測PSH組織中兩種不同細(xì)胞p53基因突變及p53蛋白的表達情況，并評價其意義，為PSH組織發(fā)生學(xué)及可能的生物學(xué)行為提供參考。 材料和方法： 一、材料收集中國醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院1995～2005年間手術(shù)切除并且病理診斷為所謂肺硬化性血管瘤及相應(yīng)病變旁正常肺組織

4、共19例。其中女性17例用于研究，男性2例用于對照。 二、免疫組化即用型鼠抗人單克隆p53抗體(DO-7)，S-P染色試劑盒及DAB顯色液均購自福州邁新公司。將蠟塊標(biāo)本制成4μm連續(xù)切片，經(jīng)脫蠟，脫苯，水化后進行HE和鏈菌素抗生物素蛋白-過氧化物酶(S-P法)免疫組化染色。以已知陽性組織為陽性對照，PBS緩沖液代替一抗為陰性對照。每張切片隨機選取5個高倍視野，每高倍視野計數(shù)100個瘤細(xì)胞，無著色及陽性細(xì)胞數(shù)≤5％為(-)，陽性細(xì)

5、胞數(shù)＞5％為(+)。p53陽性表達的判斷為單純核表達或核、漿同時表達。 三、激光捕獲目的細(xì)胞、提取DNA將蠟塊標(biāo)本制成6μm連續(xù)切片，脫蠟，脫苯至水，去離子水洗2min，Mayer's蘇木素3min，伊紅20s，梯度酒精，二甲苯透明5min。切片晾干，放置在LCM(lasercapturemicro-dissection，LCM)200型系統(tǒng)的倒置顯微鏡的載物臺上。將附有一層乙烯乙酸乙烯酯薄膜(ethylenevinylacet

6、atepolymer，EVA)的扁平塑料帽緊密覆蓋在切片的表面。定位光束標(biāo)定被選細(xì)胞，發(fā)射激光束，每份標(biāo)本分別捕獲5000個左右目的細(xì)胞。然后將塑料帽蓋于預(yù)先加有50μlDNA裂解液的0.5ml離心管上。48℃水浴14h，95℃10min滅活蛋白酶K，-20℃保存?zhèn)溆谩?四、AR、PGK基因巢式PCR擴增、電泳及染色每個標(biāo)本同時取2個5μl，一個樣品經(jīng)限制性內(nèi)切酶HhaⅠ或HpaⅡ消化，另一個樣品中用去離子水替換HhaⅠ或Hpa

7、Ⅱ酶。37℃消化10h后，70℃滅活15min。分別取5μl消化后產(chǎn)物于25μl反應(yīng)體系中進行巢式PCR擴增。外引物AR1A、AR1B或PGK1A、PGK1B各0.5μl。第二輪反應(yīng)：取1μl外引物擴增產(chǎn)物加入25μl反應(yīng)體系，含有內(nèi)引物AR2A、AR2B或PGK2A、PGK2B以相同條件擴增。取8μlAR內(nèi)引物擴增產(chǎn)物和等體積的上樣緩沖液混勻變性后加樣到6％變性聚丙烯酰胺凝膠(含尿素6mol/L)，電泳儀泳動3h(80V)。凝膠經(jīng)硝酸

8、銀染色，干膠保存。取PGK內(nèi)引物擴增產(chǎn)物5μl，經(jīng)BstⅪ酶切，45℃酶切14h。65℃滅活15min，2g/100ml瓊脂糖凝膠電泳，EB染色10min。 參考Lee等人的克隆性增生判定標(biāo)準(zhǔn)，將等位基因失活率定義為酶消化后兩個等位基因擴增強度之比與酶消化前的兩個等位基因擴增強度之比的比值；克隆率定義為病變組織與正常組織的等位基因失活率之比。如果0.25＜病變組織的克隆率≤1，則判定這個病變?yōu)槎嗫寺⌒栽錾?；如?≤病變組織的克隆

9、率≤0.25，則判定這個病變?yōu)閱慰寺⌒栽錾蝗绻?≤正常組織的等位基因失活率≤0.25，將判定為X染色體失活發(fā)生偏移。 五、p53基因PCR擴增、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)及測序分析分別取多角形細(xì)胞和表面立方細(xì)胞的DNA模板各10μl于50μlPCR反應(yīng)體系進行p53基因(5～8外顯子)PCR擴增。取6μlPCR產(chǎn)物加等量變性上樣緩沖液混勻后，100℃熱變性10min后迅速置于冰水浴中冷卻5min，然后上樣于10％非變性聚丙烯酰

10、胺凝膠(49:1)中，恒溫電泳，凝膠經(jīng)硝酸銀染色。待測樣品的電泳帶與正常對照的電泳帶相比，若出現(xiàn)條帶的增加、減少或位置的移動，即說明該樣品存在著基因突變。同時取剩余的p53基因擴增產(chǎn)物(40μl左右)進行測序分析(上海聯(lián)合基因測序部)。 實驗結(jié)果： 一、組織學(xué)觀察大多數(shù)PSH組織形態(tài)多樣，由實性區(qū)、乳頭區(qū)、血管瘤樣區(qū)和硬化區(qū)四種結(jié)構(gòu)構(gòu)成，并有不同程度的相互移行。腫瘤細(xì)胞主要有兩種：一種是位于實性區(qū)和乳頭區(qū)內(nèi)的多角形細(xì)胞，

11、胞漿淡染或嗜酸，核圓或卵圓形，有小核仁，罕見或無核分裂像。另一種是被覆在乳頭表面、血管瘤樣區(qū)間隙及實變區(qū)裂隙內(nèi)的細(xì)胞，多呈矮立方，少數(shù)呈扁平狀及高柱狀，可融合成多核巨細(xì)胞，但無異型性。血管瘤樣區(qū)表現(xiàn)為病灶腔隙增寬，腔內(nèi)含大量紅細(xì)胞。間質(zhì)內(nèi)可見淋巴細(xì)胞等炎細(xì)胞浸潤，還可見含鐵血黃素沉積、鈣化和骨化。 二、免疫組化19例PSH組織中，4例(21.1％)標(biāo)本p53蛋白呈陽性表達(陽性細(xì)胞數(shù)＞5％)，且多角形細(xì)胞的表達強度高于表面立方細(xì)

12、胞的表達；15例(78.9％)PSH組織p53蛋白呈陰性表達，其中1例標(biāo)本雖有p53蛋白呈陽性反應(yīng)的細(xì)胞，但陽性細(xì)胞數(shù)≤5％。 三、AR、PGK基因克隆性分析1.AR克隆性分析：17例女性PSH患者，15例標(biāo)本的多角形細(xì)胞和表面立方細(xì)胞的AR基因擴增成功。8例(53％)標(biāo)本有多態(tài)性。但由于其中2例瘤旁正常肺組織的X染色體失活出現(xiàn)了嚴(yán)重偏移(等位基因失活率分別為0.12，0.14)，只有6例標(biāo)本能用于克隆性分析。兩種細(xì)胞DNA經(jīng)限

13、制性內(nèi)切酶HhaⅠ消化后，均顯示相同的一條等位基因帶完全消失(克隆率=0)或不均衡的甲基化模式(克隆率=0.19)。 2.PGK克隆性分析：15例女性、1例男性PSH組織中的多角形細(xì)胞和表面立方細(xì)胞的PGK基因擴增成功。4例在BstⅪ酶切位點有多態(tài)性(27％)。兩種細(xì)胞DNA分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶HpaⅡ消化、BstⅪ酶切其PCR產(chǎn)物，結(jié)果均顯示相同等位基因的一條帶完全消失(克隆率=0)。 四、p53基因(5～8外顯子)SS

14、CP檢測及測序分析SSCP法檢測19例PSH組織p53基因突變，5例(26.3％)標(biāo)本出現(xiàn)異常移動帶。DNA測序分析結(jié)果顯示p53基因的突變率為42.1％(8/19)。從突變細(xì)胞來看，單一多角形細(xì)胞突變占5例，單一表面立方細(xì)胞突變占2例，多角形細(xì)胞和表面立方細(xì)胞同時突變1例。從突變類型來看，3例為錯義突變，4例為移碼突變，一例同時發(fā)生錯義突變和移碼突變。 五、p53基因突變和蛋白表達的比較p53蛋白陽性表達的4例PSH組織(陽性

15、細(xì)胞數(shù)＞5％)，測序分析結(jié)果顯示3例有突變發(fā)生，2例為錯義突變，1例同時發(fā)生錯義突變和移碼突變。p53蛋白陰性表達的15例組織中，14例標(biāo)本p53蛋白幾乎無陽性細(xì)胞表達(0％)，但其中4例經(jīng)測序分析證實有突變發(fā)生，且均為移碼突變；而p53蛋白陽性表達的細(xì)胞數(shù)小于5％的1例標(biāo)本，測序分析證實有突變發(fā)生，且為錯義突變。SSCP方法檢測出現(xiàn)異常移動帶的5例標(biāo)本經(jīng)測序分析證實均有突變發(fā)生。 結(jié)論： 一、PSH組織中的多角形細(xì)胞和