蘇云金桿菌Enhancin-like蛋白的鑒定及增效作用分析.pdf

1、病毒增效蛋白是金屬蛋白酶,能夠特異性降解昆蟲腸粘蛋白(IIM),從而增強病毒或是Bt殺蟲晶體蛋白對昆蟲的感染。蠟狀芽孢桿菌組發(fā)現(xiàn)了芽孢桿菌屬的基因組中含有enhancin—like基因,它編碼的肽段與病毒的增效蛋白相似性為20％～30％,研究發(fā)現(xiàn)蘇云金桿菌BMB171中的:Enhancin-like蛋白能夠降解棉鈴蟲幼蟲的腸粘蛋白從而增強cry1Ac蛋白對棉鈴蟲的毒性,與病毒增效蛋白的作用相似。細菌中Enhancin-like蛋白的增效

2、作用是否具有廣譜性尚不明確。
　　 本研究從實驗室保存的Bt菌株中篩選并成功克隆得到enhancin-like基因,提交GenBank登記,登錄號為JF806504。該基因讀碼框為2202個堿基,編碼733個氨基酸,預測的蛋白質(zhì)的分子量為84kDa。Blastn結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與病毒增效蛋白的相似性為22％～25％,與細菌增效蛋白的相似性為96～100％,并且具有保守鋅結(jié)合結(jié)構(gòu)域(HEIAH),屬于金屬蛋白酶超家族成員。
　　

3、 將重組表達質(zhì)粒pET30a-enhancin-like轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導后,SDS-PAGE檢測,enhancin—like基因在E.coli BL21(DE3)成功表達84 kDa的蛋白,再將enhancin-like基因連接到穿梭載體pSXY422b,電激轉(zhuǎn)化HD73-(cry-),構(gòu)建工程菌,Western blot分析表明,enhancin-like基因能在HD73-(cry-)中穩(wěn)定表達。<

4、br>　　 利用親和層析的方法得到純化的Enhancin-like蛋白。純化的Enhancin-like蛋白體外處理粉紋夜蛾和甜菜夜蛾圍食膜,圍食膜腸粘蛋白未降解。生物活性測定純化的Enhancin-like蛋白與Cry9Ea蛋白共同飼喂粉紋夜蛾幼蟲,與單獨用Cry9Ea蛋白飼喂粉紋夜蛾時,死亡率均為60％,而Enhancin與Cry9Ea蛋白共同飼喂粉紋夜蛾時死亡率顯著提高達到100％,Enhancin-like蛋白單獨飼喂時無殺蟲